МЕТОДИКА

Готовят в двух повторностях четыре или пять разведений испытуемого образца и стандартного образца в подходящем диапазоне концентраций ингибитора -1-протеиназы, используя трис-альбуминовый буферный раствор.

В лунки микропланшета помещают по 50 мкл разведений стандартного образца или разведений испытуемого образца, затем в каждую лунку прибавляют по 150 мкл раствора свиной панкреатической эластазы (эластаза), разведенной до необходимой концентрации трис-альбуминовым буферным раствором. Инкубируют в течение определенного промежутка времени (3 - 10 мин) при температуре от 15 °C до 25 °C. Поскольку активность различных эластаз может варьировать, для получения подходящих изменений оптической плотности при длине волны 405 нм в данных конкретных условиях проведения испытания, концентрация эластазы может быть уточнена путем оценки активности в контрольных лунках, содержащих эластазу без ингибитора -1-протеиназы.

В каждую лунку прибавляют по 100 мкл рабочего раствора хромогенного субстрата N-сукцинил-три-L-аланил-4-n-нитроанилида (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA) (раствор 4,5 мг/мл хромогенного субстрата в диметилсульфоксиде P, разведенный трис-альбуминовым буферным раствором до рабочей концентрации 0,45 мг/мл). Измерение оптической плотности (2.1.2.24) начинают сразу же и проводят в течение 5 мин и более при длине волны 405 нм, используя спектрофотометр микропланшетный. Рассчитывают скорость изменения оптической плотности .

В качестве альтернативы можно использовать метод определения в конечной точке, останавливая реакцию уксусной кислотой и измеряя оптическую плотность при длине волны 405 нм. Если испытание выполняют в пробирках и для измерения оптической плотности используют спектрофотометр, пропорционально изменяют объемы растворов реактивов.

Скорость изменения оптической плотности обратно пропорциональна активности ингибитора -1-протеиназы.

Проверяют достоверность результатов испытания и рассчитывают активность ингибитора -1-протеиназы в испытуемом образце общепринятыми статистическими методами (2.3.12.0).

201110004-2023