Для установления пригодности хроматографической системы и расчета критериев приемлемости в частных фармакопейных статьях использованы приведенные ниже определения. Ряд параметров (например, отношение сигнал/шум и разрешение) может быть рассчитан с помощью программного обеспечения, предоставляемого производителем используемого оборудования. Обеспечение соответствия способов расчета, используемых в программном обеспечении, требованиям Фармакопеи и внесение необходимых поправок в случае их несоответствия входит в ответственность пользователя.

Хроматограмма - (графическое или иное представление зависимости сигнала детектора, цвета и интенсивности зон, концентрации веществ в элюате или другой количественной величины, используемой для измерения концентрации веществ в элюате, от времени, объема или расстояния. В идеале хроматограммы представляют собой последовательность гауссовых пиков, расположенных на базовой линии (рисунок 2.1.2.36.-1).

Рисунок 2.1.2.36-1. - Схематическое изображение хроматограммы.

Пик - участок хроматограммы с записанным сигналом детектора при элюировании из колонки одного компонента (или двух и более неразделенных компонентов).

Пик может быть охарактеризован площадью пика, или высотой пика (h) и шириной пика на половине высоты (w_h), или высотой пика (h) и шириной пика между точками перегиба (w_i). Для гауссовых пиков (рисунок 2.1.2.36.-1) выполняется соотношение:

w_h = 1,18w_i.

Зона адсорбции - часть хроматографической пластинки, содержащая адсорбированное определяемое вещество и визуализируемая в виде пятна (круглого или эллипсовидного) или полосы.

Время удерживания (t_R) - время, необходимое для элюирования компонента (рисунок 2.1.2.36.-1, шкала базовой линии в минутах).

Объем удерживания (V_R) - объем подвижной фазы, необходимый для элюирования компонента. Объем удерживания может быть рассчитан по времени удерживания и скорости подвижной фазы (F) (в миллилитрах в минуту) по формуле:

V_R = t_R x F.

"Мертвое" время (t_M) - время, необходимое для элюирования неудерживаемого компонента (рисунок 2.1.2.36.-1, шкала базовой линии в минутах). В эксклюзионной хроматографии используют символ t₀ (см. ниже).

"Мертвый" объем (V_М) - объем подвижной фазы, необходимый для элюирования неудерживаемого компонента. "Мертвый" объем может быть рассчитан по "мертвому" времени и скорости подвижной фазы (F) (в миллилитрах в минуту) по формуле:

V_М = t_М x F.

В эксклюзионной хроматографии используют символ V₀ (см. ниже).

Коэффициент удерживания (k) - характеристика, определяемая по формуле:

,

где: K_С - константа распределения (известная также как коэффициент равновесного распределения);

V_s - объем неподвижной фазы;

V_М - объем подвижной фазы.

Коэффициент удерживания компонента может быть определен из хроматограммы по формуле:

.

Общее время подвижной фазы (t_i) - время удерживания компонента, молекулы которого меньше, чем размер наименьшей поры геля в эксклюзионной хроматографии (известное также как полное время эксклюзии) (рисунок 2.1.2.36.-2).

Рисунок 2.1.2.36.-2 - Временные/объемные показатели хроматограмм.

Полный объем эксклюзии (V_t) - объем удерживания компонента, молекулы которого меньше, чем размер наименьшей поры геля в эксклюзионной хроматографии. Полный объем эксклюзии может быть рассчитан по общему времени подвижной фазы и скорости подвижной фазы (F) (в миллилитрах в минуту) по формуле:

V_t = t_t x F.

Время удерживания неудерживаемого компонента (t₀) - время удерживания компонента, молекулы которого больше, чем размер наибольшей поры геля в эксклюзионной хроматографии (рисунок 2.1.2.36.-2).

Объем удерживания неудерживаемого компонента (V₀) - объем удерживания компонента, молекулы которого больше, чем размер наибольшей поры геля в эксклюзионной хроматографии. Объем удерживания неудерживаемого компонента может быть рассчитан по времени удерживания неудерживаемого компонента и скорости подвижной фазы (F) (в миллилитрах в минуту) по формуле:

V₀ = t₀ x F.

Константа распределения (K₀) - характеристика элюентных свойств компонента в определенной колонке в эксклюзионной хроматографии, рассчитываемая по формуле:

.

Коэффициент замедления (R_F) - характеристика относительной скорости перемещения компонента в тонком слое (известная также как коэффициент удерживания (R_f) в плоскостной хроматографии). Коэффициент замедления равен отношению расстояния от точки нанесения пробы до центра зоны адсорбции и расстояния, пройденного фронтом растворителя от точки нанесения пробы (рисунок 2.1.2.36.-3):

,

где: b - расстояние, пройденное компонентом;

a - расстояние, пройденное фронтом растворителя.

Рисунок 2.1.2.36.-3 - Схематическое изображение тонкослойной хроматограммы. A - фронт подвижной фазы; B - пятно; C - линия нанесения пробы (линия старта).

Число теоретических тарелок (N) - характеристика эффективности (кажущейся эффективности) колонки. Число теоретических тарелок может быть рассчитано по данным, полученным в зависимости от методики как при изотермическом или изократическом режимах, так и режиме постоянной плотности по формуле, в которой величины t_R и w_h должны быть выражены в одинаковых единицах:

,

где: t_R - время удерживания пика компонента;

w_h - ширина пика на половине его высоты.

Число теоретических тарелок зависит как от компонента, так и используемой колонки и ее температуры, а также от подвижной фазы и времени удерживания.

Объем задержки (D) - объем между точкой, при которой происходит смешение элюентов, и входом в колонку (известный также как объем задержки градиента). Объем задержки может быть определен в приведенных ниже условиях хроматографирования.

Колонка: хроматографическую колонку заменяют подходящей капиллярной трубкой (например, длиной 1 м и внутренним диаметром 0,12 мм);

Подвижная фаза:

- подвижная фаза A: вода P;

- подвижная фаза B: 0,1% (об/об) раствор ацетона P;

Скорость подвижной фазы: устанавливают до достаточного обратного давления (например, 2 мл/мин);

Детектирование: спектрофотометр, при длине волны 265 нм,

Определяют время (t_0,5) (в минутах), при котором оптическая плотность увеличивается на 50% (рисунок 2.1.2.36.-4).

Рисунок 2.1.2.36.-4. - Определение объема градиентной задержки.

D = t_D x F,

где: t_D - t_0,5 - 0,5t_G (в минутах);

t_G - предварительно установленное время градиента (равное 20 мин);

F - скорость подвижной фазы (в миллилитрах в минуту).

Коэффициент симметрии (A_s) - характеристика симметричности пика, (рисунок 2.1.2.36.-5), рассчитываемая по формуле:

,

где: w_0,05 - ширина пика на одной двадцатой его высоты;

d - расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передней границей пика на одной двадцатой его высоты.

Рисунок 2.1.2.36.-5. - Схематическое изображение пика с растянутым задним фронтом.

Значение A_s, равное 1,0, означает полную симметрию. Если A_s > 1,0, пик имеет растянутый задний фронт ("хвост"); если A_s < 1,0, пик имеет растянутый передний фронт.

Разрешение (R_s) - характеристика степени разделения между пиками двух компонентов (рисунок 2.1.2.36.-6), которая может быть рассчитана по формуле:

,

где: t_R2 > t_R1

t_R1 и t_R2 - времена удерживания пиков;

w_h1 и w_h2 - ширина пиков на половине высоты.

Рисунок 2.1.2.36.-6. - Схематическое изображение неразделившихся пиков.

В количественной плоскостной хроматографии с использованием денситометрии вместо времен удерживания используют пройденные расстояния, и разрешение между пиками двух компонентов рассчитывают по формуле:

,

где: R_F1 и R_F2 - коэффициенты замедления пиков;

w_h1 и w_h2 - ширина пиков на половине их высоты;

a - расстояние, пройденное фронтом растворителя.

Отношение пик/впадина (p/v) - характеристика, используемая в качестве критерия пригодности хроматографической системы в испытании на родственные примеси, когда разделение двух пиков до базовой линии не достигнуто (рисунок 2.1.2.36.-7). Отношение пик/впадина рассчитывают по формуле:

,

где: H_p - высота меньшего пика относительно экстраполированной базовой линии;

H_v - высота над экстраполированной базовой линией наиболее низкой точки кривой, разделяющей меньший и больший пики.

Рисунок 2.1.2.36.-7. - Схематическое изображение параметров для расчета отношения сигнал/шум.

Относительное удерживание (r) (характеристика, рассчитываемая по формуле:

,

где: t_Ri - время удерживания пика определяемого компонента;

t_Rst - время удерживания пика сравнения (обычно пик испытуемого вещества);

t_М - "мертвое" время.

Неоткорректированное относительное удерживание (r_G) рассчитывают по формуле:

.

При отсутствии других указаний значения относительного удерживания, указанные в частных фармакопейных статьях, соответствуют неоткорректированному относительному удерживанию.

В плоскостной хроматографии вместо t_Rst и t_Ri используют коэффициенты замедления R_St и R_Fi. Полученное значение является коэффициентом R_St.

Отношение сигнал/шум (S/N) - характеристика влияния кратковременного шума на прецизионность количественного определения. Отношение сигнал/шум рассчитывают по формуле:

,

где: H - высота пика (рисунок 2.1.2.36.-7) рассматриваемого компонента на хроматограмме указанного раствора сравнения; высоту измеряют от максимума пика до экстраполированной базовой линии сигнала, наблюдаемого на расстоянии, равном не менее пятикратной ширине пика на половине его высоты;

h - область фонового шума на хроматограмме, полученной при введении или нанесении контрольного раствора, наблюдаемая на расстоянии, равном не менее пятикратной ширине пика на половине высоты пика на хроматограмме указанного раствора сравнения, и, по возможности, расположенная по обе равные стороны от места возможного обнаружения пика.

Повторяемость системы - характеристика сигнала, выражаемая в виде рассчитанного относительного стандартного отклонения в процентах (s_r (%)) последовательных серий измерений для не менее трех введений или нанесений раствора сравнения и рассчитываемая по формуле:

,

где: y₁ - индивидуальные значения площади пика, высоты пика или отношения площадей в методе внутреннего стандарта;

- среднее индивидуальных значений;

n - число индивидуальных значений.

Неучитываемый предел - предел, при котором и ниже которого пики не учитываются.