АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ

Проточная цитометрия

Принцип испытания. Испытание основано на способности определенных красителей проникать через поврежденные мембраны и связываться с ДНК путем интеркалирования между основаниями, вследствие чего флюоресценцию нежизнеспособных клеток можно зарегистрировать с помощью проточной цитометрии (2.1.6.16). Нежизнеспособные клетки оценивают по различиям, выявляемым при окрашивании клеток, тогда как жизнеспособные клетки остаются неокрашенными. Анализ обычно выполняют с использованием 7-аминоактиномицина D (7-ААД) или пропидий-йодида, допустимо использование других подходящих красителей.

Красители. Мембранопроникающие вещества, например, 7-ААД и пропидий-йодид, могут быть использованы в качестве красителей для определения жизнеспособности клеток.

7-ААД является аналогом актиномицина D, у которого в положении 7 хромофора заменена аминокислотная группа. 7-ААД интеркалирует между цитозиновыми и гуаниновыми основаниями ДНК. Спектральные свойства 7-ААД позволяют использовать его как краситель для анализа методом проточной цитометрии. Максимум поглощения комплекса 7-ААД/ДНК расположен в зеленом диапазоне спектра и является подходящим для определения количества клеток с помощью цитометра, оснащенного аргоновым лазером (длина волны возбуждения 488 нм). Насыщенная красная флуоресцентная эмиссия 7-ААД (от 635 нм до 675 нм) обуславливает возможность его применения в комбинации с антителами, конъюгированными с флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) и фикоэритрином (ФЭ), поскольку, в отличие от пропидий-йодида, комплекс 7-ААД/ДНК имеет минимальное спектральное наложение с ФИТЦ и ФЭ.

Пропидий-йодид связывается с двухнитевой ДНК путем интеркалирования между парами оснований с небольшими предпочтениями или без них и со стехиометрией, соответствующей одной молекуле красителя на 4 - 5 пар оснований ДНК. Флуоресценция образовавшегося комплекса красителя с нуклеиновыми кислотами увеличивается в 20 - 30 раз, при этом максимум возбуждения флуоресценции смещается приблизительно на 30 - 40 нм в красную область, а максимум эмиссии флуоресценции (615 нм) - приблизительно на 15 нм в синюю область. Хотя способность пропидий-йодида к оптическому поглощению довольно низка, он проявляет достаточно большой Стоксовский сдвиг (разница длин волн максимумов спектров поглощения и флуоресценции), что позволяет одновременно обнаруживать нуклеиновые кислоты и антитела, меченные флуоресцеином при условии использования подходящих оптических фильтров.

Условия хранения растворов красителей нуклеиновой кислоты. При температуре от 2 °C до 8 °C.

Подготовка к испытанию и анализ. В случае гемопоэтических клеток краситель может быть добавлен после маркирования CD45+ на клетках для лучшего разделения клеток от клеточных фрагментов (дебриса) и тромбоцитов на основе установления области соответствия объектов по боковому светорассеянию (SS) и мечения CD45+. Условия инкубации клеточной суспензии с красителем должны быть валидированы.

Инкубацию выполняют при температуре от 15 °C до 25 °C, в защищенном от света условиях. При необходимости выполняют лизис эритроцитов, используя, например, аммония хлорид. Если в проведении лизиса нет необходимости, прибавляют только буферный раствор.

Процентное содержание жизнеспособных клеток определяют непосредственно с помощью проточного цитометра и анализа положительных клеток (нежизнеспособные клетки) на SS/7-ААД или SS/пропидий-йодид цитограммах графиках.

Положительные контроли могут состоять из стабилизированных клеток (нежизнеспособные клетки), смешанных со свежими жизнеспособными клетками в необходимом соотношении.

Цифровое изображение окрашенных клеток

Цифровое изображение позволяет автоматизировать методы с использованием световой микроскопии. Суспензию клеток и раствор красителя смешивают непосредственно в приборе. Система, которая позволяет проводить аспирацию образца, работу с реактивами и последующую очистку оборудования, полностью автоматизирована. Как только клеточная суспензия была отобрана и смешана с раствором красителя, она подается в проточную ячейку для анализа. Окрашенная клеточная суспензия протекает через камеру, где стробоскопический свет позволяет фотокамере фотографировать проходящие через счетную камеру клетки. Изображение оцифровывается, и число нежизнеспособных или жизнеспособных клеток подсчитывают с использованием программного обеспечения.

201110010-2023