IV. Требования к проведению исследований и показатели (условия) безопасности ГМО

15. Требования к проведению исследований и показатели (условия) безопасности ГМО, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения, содержащих жизнеспособный ГМО:

а) для ГМО-вирусов определение инфекционной активности (цитопатическое действие и титр вируса) проводится в культурах клеток или иных тест-объектах, чувствительных к исходному организму-реципиенту, согласно информации, представленной заявителем в соответствии с пунктом 7 настоящей Методики. Для контроля исследуют инфекционную активность (цитопатическое действие и титр вируса) исходного организма-реципиента. Условия эксперимента для исходного организма-реципиента и ГМО должны совпадать. Величина инфекционной активности (цитопатическое действие и титр вируса) для ГМО-вируса не должна превышать инфекционную активность исходного организма-реципиента;

б) исследования микробиологических свойств, чувствительности к антибиотикам и бактериофагам, гемолитической активности на эритроцитах животных должны проводиться в отношении штаммов ГМО-бактерий. Эксперименты проводят с использованием компонентов (сред, диагностических панелей, антибиотиков, бактериофагов и т.д.) и методов согласно информации, представленной заявителем в соответствии с пунктом 7 настоящей Методики. Определение микробиологических свойств, чувствительности к антибиотикам и бактериофагам, гемолитической активности ГМО проводят с использованием в качестве контроля исходного организма-реципиента. Условия эксперимента для исходного организма-реципиента и ГМО должны совпадать.

Микробиологические свойства, чувствительность к антибиотикам и бактериофагам, гемолитическая активность ГМО не должны отличаться от свойств исходного организма-реципиента в части, не затронутой генетической модификацией;

в) стабильность свойств ГМО-бактерий, простейших, грибов должна проверяться при пассировании исследуемых штаммов на жидких и плотных питательных средах с тестированием фенотипических (биохимических) свойств через 6 последовательных пассажей. Молекулярно-генетическими методами исследуют исходный ГМО и ГМО после шестикратного пассирования. Стабильными являются штаммы ГМО-бактерий, простейших, грибов, не изменившие фенотипических (биохимических) свойств и сохранившие генетическую структуру после проведения шестикратного пассирования. ГМО-бактерии, простейшие, грибы должны демонстрировать стабильность фенотипических (биохимических) свойств и генетической структуры;

г) исследования стабильности ГМО-вирусов должны проводиться вирусологическими и молекулярно-генетическими методами. Исследование вирусологическими методами проводится на соответствующей культуре клеток или в восприимчивых живых организмах проведением 6 (шести) последовательных пассажей ГМО-вирусов. Молекулярно-генетическими методами исследуют исходный ГМО-вирус и ГМО-вирус после шестикратного пассирования. Стабильными являются штаммы ГМО-вирусов, у которых не наблюдается увеличение вирулентности (в том числе изменение клинических проявлений, появление нежелательных реакций на введение) и сохраняется генетическая структура после проведения шестикратного пассирования. ГМО-вирусы должны демонстрировать стабильность вирулентных свойств и генетической структуры;

д) исследования вирулентности ГМО на лабораторных животных должны проводиться на свободных от специфических патогенов (далее - SPF) лабораторных животных с определением летальной дозы для 50% лабораторных животных (далее - ЛД50). Определение ЛД50 проводится согласно информации, представленной заявителем для штамма исходного организма-реципиента в соответствии с пунктом 7 настоящей Методики, путем введения группе животных исследуемого ГМО штамма. При проведении испытания формируют две контрольных группы животных, одной группе вводят стерильный физиологический раствор, второй группе животных вводят исходный организм-реципиент. Животных каждой группы помещают в отдельные клетки и наблюдают в течение 10 дней. По завершении эксперимента подсчитывают гибель животных в каждой группе и определяют ЛД50. ЛД50 для штамма ГМО не должна быть меньше ЛД50 исходного организма-реципиента;

е) исследование жизнестойкости ГМО на объектах окружающей среды, на влажных опилках, ватных тампонах, после термической обработки должно проводиться с использованием питательных сред, культур клеток или иных тест-объектов, чувствительных к исходному организму-реципиенту, согласно информации, представленной заявителем в соответствии с пунктом 7 настоящей Методики. Эксперименты проводят с использованием в качестве контроля исходного организма-реципиента. Условия эксперимента для исходного организма-реципиента и ГМО должны совпадать. Жизнестойкость ГМО в окружающей среде не должна превышать жизнестойкость исходного организма-реципиента;

ж) исследование тканевого тропизма ГМО должно проводиться с использованием целевых животных путем выделения (изолирования) ГМО из лейкоцитов, селезенки, тимуса и других органов животных. Эксперименты проводят с использованием в качестве контроля исходного организма-реципиента. Условия эксперимента для исходного организма-реципиента и ГМО должны совпадать. ГМО должен выделяться из тех же тканей, что и исходный организм-реципиент;

з) определение адгезивности ГМО должно проводиться методом гемагглютинации эритроцитов с использованием эритроцитов согласно информации, представленной заявителем в соответствии с пунктом 7 настоящей Методики. Эксперименты проводят с использованием в качестве контроля исходного организма-реципиента. Условия эксперимента для исходного организма-реципиента и ГМО должны совпадать. При выявлении гемагглютинационной активности ГМО, предназначенных для производства пробиотиков, должно проводиться определение адгезивности в присутствии D-маннозы для определения маннозочувствительной или маннозорезистентной адгезии. Количественное определение адгезии должно проводиться при использовании биологических моделей. ГМО должен иметь коэффициент адгезии, не превышающий коэффициент адгезии исходного организма-реципиента;

и) определение инвазивности ГМО с помощью кератоконъюнктивальной пробы должно осуществляться путем внедрения ГМО и исходного организма-реципиента в качестве контроля в эпителиальные клетки конъюнктивы и роговицу лабораторных животных для оценки размножения в них. Условия эксперимента для исходного организма-реципиента и ГМО должны совпадать. Инвазивность ГМО не должна превышать инвазивность исходного организма-реципиента;

к) при определении антагонистической активности ГМО, предназначенных для производства пробиотиков, для контроля должны использоваться исходный организм-реципиент и тест-штаммы микроорганизмов, представляющие основные виды резидентной кишечной микрофлоры животных-реципиентов (грамположительные: облигатно-анаэробные бактерии - лактобактерии, бифидобактерии, пептостептококки; грамотрицательные: облигатно-анаэробные бактерии, бактероиды, факультативно-анаэробные микроорганизмы, кишечная палочка, стафилококки, стрептококки, дрожжеподобные грибы рода Candida). Уровень антагонистической активности в отношении штаммов резидентной микрофлоры определяют методом отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов. Антагонистическое действие ГМО не должно проявляться к представителям резидентной микрофлоры и не должно превышать антагонистическую активность исходного организма-реципиента;

л) иммунологические исследования ГМО, предназначенных для производства пробиотиков, должны проводиться на мышах линий СВА, высокочувствительных к введению эритроцитов барана и нечувствительных к гистамину и Salmonella typhimurium, и С57В1/6, низкочувствительных к введению эритроцитов барана, чувствительных к гистамину и Salmonella typhimurium, и включают изучение иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам: действие на гуморальное звено иммунитета в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана; действие на клеточное звено иммунитета в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана; действие как сенсибилизирующего агента в тесте чувствительности к гистамину; действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium. Эксперименты проводят с использованием в качестве контроля исходного организма-реципиента. Условия эксперимента для исходного организма-реципиента и ГМО должны совпадать. ГМО должен быть не менее безопасен, чем исходный организм-реципиент;

м) исследования безопасности использования ГМО на животных-реципиентах осуществляются путем введения лекарственного средства, содержащего ГМО, животным-реципиентам в десятикратной дозе. Наблюдения должны проводиться в течение 30 дней. В протоколе исследования регистрируются персистенция и выделение ГМО из организма подопытных животных, падеж, клиническое состояние, клинические и биохимические показатели крови, местная реакция на введение препарата, содержащего ГМО. Введение подопытным животным лекарственного средства, содержащего ГМО, не должно вызывать клинических изменений, показатели крови не должны отклоняться от физиологической нормы, не должны выявляться патологоанатомические изменения при вскрытии.

16. Требования к проведению исследований и показатели (условия) безопасности ГМО, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения, содержащих нежизнеспособный ГМО:

а) исследования образцов лекарственного средства на отсутствие жизнеспособного ГМО должны проводиться с использованием микробиологических (вирусологических) методов. В качестве контрольных посевов и (или) пассажей используется живая культура штамма-реципиента;

б) исследования по изучению безопасности использования образцов лекарственного средства для животных-реципиентов должны проводиться путем введения животным десятикратной дозы лекарственного средства. Наблюдения проводятся в течение 30 дней. В протоколе исследования регистрируются падеж, клиническое состояние животных, гематологические и биохимические показатели крови, локальные аллергические реакции на введение образца лекарственного средства. Введение животным курса образцов лекарственного средства не должно вызывать клинических изменений, показатели крови не должны отклоняться от физиологической нормы, не должны выявляться патологоанатомические изменения при вскрытии.