2.3 Лабораторная диагностика

- Рекомендуется проведение неонатального скрининга (определение концентрации фенилаланина в сухих пятнах крови) для доклинической диагностики гиперфенилаланинемии и своевременного начала патогенетической терапии [1, 4, 11, 14, 19].

(Сила рекомендации A; уровень убедительности доказательств II)

Комментарии: Все формы ГФА можно диагностировать уже в первые недели или даже дни жизни ребенка, когда клинические проявления еще отсутствуют. Для этого проводят биохимический скрининг новорожденных на наличие гиперфенилаланинемии. Подробная схема проведения неонатального скрининга представлена в приложении Г2, описание правил взятия крови представлено в приложении Г3.

- Рекомендуется использовать для неонатального скрининга методы флюориметрии или тандемной массс-пектрометрии [1, 4, 11, 14].

(Сила рекомендации A; уровень убедительности доказательств II)

Комментарии: Флюориметрия - количественный биохимический метод определения фенилаланина в крови с помощью современных автоматических флюориметров широко используется для проведения массового автоматизированного скрининга; тандемная масс-спектрометрия - аналитический метод исследования, основанный на определении отношения массы (https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%B0%D1%81%D1%81%D0%B0) к заряду (https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D1%80%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA% ионов, образующихся при ионизации (https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0%BE%D0%BD%D0%B8%D0%B7%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F) исследуемых компонентов пробы, осуществляет качественную и количественную идентификацию аминокислот, позволяет одновременно определять уровень фенилаланина и тирозина, соотношение концентраций позволяет косвенно оценить степень снижения активности фенилаланингидроксилазы.

- Главным критерием диагностики ГФА рекомендовано считать повышенное содержание фенилаланина в крови.

(Сила рекомендации A; уровень убедительности доказательств II)

Комментарии: Для всех указанных методов уровень ФА в крови человека выше 2,0 мг/дл (120 мкмоль/л) квалифицируют как гиперфенилаланинемию. ГФА с уровнем выше 10,0 мг/дл (600 мкмоль/л) относят к различным формам ФКУ.

- Рекомендуется проведение дифференциальной диагностики ФКУ и других ГФА (второй этап скрининга) [1, 4, 11, 15, 19].

(Сила рекомендации A; уровень убедительности доказательств II)

Комментарии. Второй этап скрининга необходим для выявления BH4 зависимых форм гиперфенилаланинемии и своевременного назначения патогенетической терапии. В настоящий момент для этого используется определение соотношения фенилаланин/тирозин (косвенно отражает наличие дефицита фермента PAH) и ДНК диагностика [4, 7, 14, 17].

- При отсутствии данных неонатального скрининга диагностику заболевания рекомендовано осуществлять на основании совокупности генеалогического анамнеза, результатов клинического и биохимического обследования [4, 7, 14, 15, 20].

(Сила рекомендации C; уровень убедительности доказательств II)

Комментарии: В этих случаях главным для установления диагноза остается биохимический критерий - высокое содержание фенилаланина в сыворотке крови при отсутствии патогенетического лечения. В дальнейшем показано проведение молекулярной диагностики.

- Рекомендуется ДНК диагностика с целью выявления мутаций в генах PAH и PTP.

(Сила рекомендации A; уровень убедительности доказательств II)

Комментарии. ДНК диагностика проводится с целью дифференциальной диагностики и для определения характера мутаций, что в дальнейшем помогает определить контингент пациентов для проведения теста на чувствительность к лечению сапроптерином Существующие наборы позволяют определять частые мутации в гене PAH, имеющиеся у 80% больных ФКУ. При отсутствии исследуемых мутаций у пациента рекомендуется проведение секвенирования гена PAH. Также проводится ДНК диагностика мутаций и секвенирование генов (PTPS, DHPR, PCD и др.), кодирующих известные ферменты различных стадий метаболизма тетрагидробиоптерина.

В настоящее время известно более 800 мутаций в гене PAH, спектр и распространенность которых имеет этнические особенности. Для европеоидной расы мажорной мутацией в гене PAH является мутация R408W, в то время как в Японии и Китае данная мутация не найдена. Во многих европейских популяциях с относительно высокой частотой регистрируются следующие мутации: IVS12nt1, R261Q, R252W, R158Q, P281L, IVS10nt546, I65T.

Большинство генетических изменений гена PAH - это миссенс-мутации во всех 13 экзонах гена или нетранслируемых фланкирующих участках гена, составляющие 59% всех вариантов. Также обнаружены мутации сплайсинга, нонсенс-мутации, мутации сдвига рамки считывания, более крупные делеции и инсерции. Разные мутации влияют на работу фермента PAH в различной степени - этим может объясняться большое разнообразие показателя ФА в крови больных ФКУ. Большое количество мутаций гена PAH (например, R408W) приводят к резидуальной активности фермента ФАГ. При других мутациях (E390G, Y414C, A300) толерантность к фенилалалнину выше и клиническая картина ФКУ менее выражена. Таким образом, по современным данным (Hentz et al., 2013) результаты генотипирования при ФКУ потенциально обладают предиктивным значением.

Следует отметить, что при определенных мутациях в гене PAH, обусловливающих остаточную активность фермента ФАГ, введение кофактора BH4 или его синтетических аналогов в терапию приводит к повышению или восстановлению активности фенилаланингидроксилазы, что позволяет расширить диету с увеличением в рационе квоты натурального белка.