2.3. Лабораторная

Как уже отмечалось, клиническая картина ОПЛ имеет достаточно яркие характеристики, и диагноз этого варианта ОМЛ может быть заподозрен даже до выполнения необходимых лабораторных тестов. При этом в клинической практике можно столкнуться и со случаями ОПЛ, которые протекают не столь драматично, - отсутствуют проявления геморрагического синдрома, больные в течение нескольких недель могут наблюдаться по поводу лейкопении, умеренной тромбоцитопении.

У 80% больных манифестация заболевания характеризуется лейкопенией (медиана числа лейкоцитов составляет 1,8 * 109/л). Хотелось бы отметить, что если у больного в момент 2.3.1. Морфологическая оценка бластных клеток.

В большинстве случаев диагноз может быть заподозрен при морфологической оценке лейкемических клеток. Властные клетки при ОПЛ в большинстве прежде всего характеризуются значительным ядерным полиморфизмом и наличием крупной фиолетово-бурой зернистости, густо заполняющей цитоплазму, большим количеством палочек Ауэра (классический гипергранулярный вариант ОПЛ). У 15 - 20% больных в цитоплазме опухолевых клеток обнаруживается лишь несколько мелких гранул или они не выявляются вовсе, при этом все остальные признаки (клинические, цитохимические, цитогенетические) ОПЛ присутствуют.

Классическим признаком опухолевых клеток ОПЛ является очень выраженная цитохимическая реакция на миелопероксидазу (МРО), липиды, которая выявляется с помощью суданового черного (SBB), и на хлорацетатэстеразу.

Рабочая группа рекомендует:

- Рекомендуется проведение следующих исследований до начала 2.3.2. Иммунофенотипирование бластных клеток

Иммунофенотипирование с использованием многоцветной проточной цитометрии может повысить точность морфологических исследований ОПЛ, но не является ключевым методом 2.3.3. Быстрое генетическое подтверждение диагноза

Поскольку эффективность таргетного 2.3.4. Кариотипирование.

Кариотипирование на G-окрашенных метафазах, полученных из образцов костного мозга (КМ) выполняется обычными методами на прямой, 24-часовой и 48-часовой культуре. Несмотря на высокую специфичность, цитогенетический анализ дорог, отнимает много времени, нуждается в метафазах хорошего качества (потери до 20%), и по определению, не в состоянии обнаружить случаи, когда PML / RARA является результатом так называемой криптогенной перестройки (ложно отрицательный результат).

Этот метод позволяет обнаруживать дополнительные хромосомные перестройки, но они не имеют существенного прогностического значения при ОПЛ. Также, цитогенетический анализ может быть полезен в тех случаях ОПЛ, когда синтез химерного белка PML/RARA не осуществляется. Стандартная цитогенетика также может способствовать выявлению редких вариантов ОПЛ в том числе с t(11, 17) (q23; q21), t(11, 17) (q13; q21) и t(5, 17) (q35; q21), приводящих к синтезу химерных продуктов PLZF-RARA, NuMA RARA и NPM1-RARA соответственно, а также другим, описанным совсем недавно.

Рабочая группа рекомендует:

- Рекомендуется до начала 2.3.5. FISH (флюоресцентная in situ гибридизация).

FISH анализ PML/RARa выполняется с использованием флуоресцентных зондов. Хотя в некоторых случаях образцы периферической крови (ПК) пригодны для исследования (в частности, когда на момент установления диагноза имеется гиперлейкоцитоз), FISH анализ лучше выполнять на образцах КМ. Этот метод высоко специфичен, обладает достаточной чувствительностью, намного дешевле и менее трудоемок, чем кариотипирование. Однако FISH не дает никакой информации об изоформе химерного транскрипта PML/RARA, который необходим для осуществления молекулярного мониторинга минимальной остаточной болезни.

Тем не менее, FISH может быть полезен в 2.3.6. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

ОТ-ПЦР анализ PML-RARa проводят на РНК, выделенной из клеток КМ, хотя химерный транскрипт, как правило, легко определяется и в ПК, даже в случаях с лейкопенией. ОТ-ПЦР анализ для выявления химерного продукта PML-RARA был созданы стандартизован в рамках международной кооперации (Biomed-1 Concerted Action). ОТ-ПЦР является "золотым стандартом" для подтверждения диагноза ОПЛ. Помимо своей высокой специфичности и чувствительности, важно, он определяет расположение очки разрыва PML, устанавливая тем самым маркер для следующего мониторинга МОБ. Однако, малое количество РНК (и как следствие - ложноотрицательный результат), контаминация/артефакты (ложноположительный результат), а также относительно длительный период пробоподготовки (около 2 дней) являются основными недостатками этого метода. Кроме того, очень желательно, чтобы детекцию химерных транскриптов и мониторинг образцов проводили в референс-лабораториях с хорошо обученным персоналом и большим опытом.

Рабочая группа рекомендует:

- Рекомендуется до начала 2.3.7. Иммуноокрашивание с помощью анти-PML моноклональных антител

Иммуноокрашивание с помощью анти-PML моноклональных антител на сухих мазках КМ или ПК (при условии наличия бластных клеток) позволяет очень быстро установить диагноз. Этот метод является весьма специфичным при наличии химерного белка PML-RAR. Результат иммунофлуоресцентного анализа может быть получен в течение всего 2-х часов. К сожалению, этот тест не применяется в РФ.

Все вышеупомянутые методы 2.3.8. Исследования дополнительных молекулярных маркеров.

Мутации в гене, кодирующем FMS-подобную тирозинкиназу 3 (FLT3), при ОПЛ наблюдаются чаще, чем при других ОМЛ - у 30 - 40% больных. Однако, хотя FLT3-мутации ассоциированы с более высоким числом лейкоцитов в момент 2.3.9. Подготовка образцов для молекулярно-генетических исследований и их хранение

FISH

Для FISH необходимо от 3 до 4 мазков КМ и от 3 до 4 мазков ПК, полученных на момент установления диагноза. Образцы могут быть отправлены при комнатной температуре. Мазки, которые не используются немедленно, должны храниться на -20 °C, покрытые алюминиевой бумагой.

ОТ-ПЦР.

Для выделения РНК и ОТ-ПЦР, требуется одна пробирка с КМ (2 - 3 мл) или одна пробирка с ПК (20 - 30 мл, поскольку часто при ОПЛ регистрируется глубокая лейкопения), содержащая либо цитрат натрия, либо этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). Образцы костного мозга или периферической крови должны быть обработаны в течение 24 часов. Выделенные мононуклеарные клетки в гуанидине изотиоцианате могут храниться на -20 °C. Для всех исследований предпочтителен костный мозг.

Кариотипирование и FISH.

Для обычного кариотипирования и FISH исследования, КМ объемом (1 - 2 мл) должен быть помещен в пробирку с гепарином и отправлен при комнатной температуре. Образцы, обработанные при поступлении в лабораторию в виде осажденных ядер, фиксированных с помощью метанола и уксусной кислоты (3:1), могут храниться при температуре -20 °C.

Для подтверждения диагноза ОПЛ и мониторирования в дальнейшем

Рабочая группа рекомендует:

- Рекомендуется при возникновении подозрений на ОПЛ клиническую ситуацию и любые действия в отношении больного расценивать как неотложные.

Уровень убедительности рекомендации C (уровень достоверности доказательств - 4) [1 - 6].

- Рекомендуется подтверждение диагноза ОПЛ молекулярно-генетическими методами (стандартная цитогенетика, FISH и РТ-ПЦР). Самым быстрым методом, подтверждающим диагноз ОПЛ, является метод FISH.

Уровень убедительности рекомендации B (уровень достоверности доказательств - 2) [1 - 6].

- Рекомендуется методом РТ-ПЦР определить вариант химерного транскрипта PML-RARa (или другой более редкий вариант) для выполнения в дальнейшем мониторинга минимальной резидуальной болезни.

Уровень убедительности рекомендации B (уровень достоверности доказательств - 2) [1 - 6].