V. Требования к проведению исследований и показатели (условия) безопасности ГМО, являющегося микроорганизмом

19. Требования к проведению исследований и показатели (условия) безопасности ГМО для производства кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением жизнеспособного ГМО, являющегося микроорганизмом, или содержащих такой организм:

а) токсикологические исследования на лабораторных животных должны проводиться на самцах и самках крыс или мышей (в зависимости от вида животных, сведения о которых представлены заявителем в соответствии с пунктом 7 настоящей Методики) в течение 90 календарных дней при соотношении полов 1:1. Животные должны быть разделены на 2 равные группы: группа "контроль" и группа "опыт". Группа "контроль" должна получать рацион с включением исходного организма-реципиента; группа "опыт" должна получать рацион с включением исследуемого ГМО. Обе группы животных должны получать одинаковый по объему и составу рацион, за исключением включенного исследуемого ГМО или исходного организма-реципиента. Исследуемый ГМО и исходный организм-реципиент должен быть включен в состав корма в равном количестве. Животные должны иметь доступ к корму и воде, содержаться в помещении с системой отопления и регулируемым микроклиматом.

Должны исследоваться следующие показатели состояния животных:

персистенция и выделение ГМО из организма животных;

общее состояние животных: внешний вид, двигательная активность, состояние шерстного покрова - каждые 2 календарных дня; поедаемость корма - ежедневно; масса тела - каждые 7 календарных дней;

гематологические показатели крови: концентрация гемоглобина; гематокрит; общее количество эритроцитов; средний объем эритроцита (СОЭ); среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССЭ); средняя концентрация гемоглобина в эритроците (СКЭ); общее количество тромбоцитов; общее количество лейкоцитов; дифференцированный подсчет лейкоцитов (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы);

биохимические показатели крови: аланинаминотрансфераза (АЛТ); аспартатаминотрансфераза (АСТ); желчные кислоты; фосфатаза щелочная; билирубин общий; билирубин прямой; белок общий; альбумин; глобулин; креатинин; глюкоза; альфа-амилаза; липаза; лактатдегидрогеназа; общие липиды; триглицериды; холестерин; холинэстераза; мочевина; хлориды; натрий; фосфор; калий;

общий анализ мочи: цвет и прозрачность; относительная плотность; pH; белок; глюкоза; креатинин.

Исследование гематологических и биохимических показателей крови, персистенции и показателей мочи должны проводиться на 90-й календарный день опыта у 50% животных из каждой группы. По окончании восстановительного периода (10-й календарный день со дня окончания дачи рациона с ГМО, 101-й календарный день опыта) должны проводиться те же исследования у второй половины животных каждой группы.

Скармливание животным рациона, содержащего ГМО, не должно вызывать клинических изменений (показатели крови, мочи, общего состояния животных группы "опыт", персистенции и выделения ГМО не должны отклоняться от показателей группы "контроль"), не должны выявляться патологоанатомические изменения при вскрытии;

б) аллергологические исследования ГМО на лабораторных животных должны проводиться на крысах линии Вистар. Животные должны быть разделены на 2 равные группы: группа "контроль" и группа "опыт". Группа "контроль" должна получать рацион с включением исходного организма-реципиента; группа "опыт" должна получать рацион с включением исследуемого ГМО. Обе группы животных должны получать одинаковый по объему и составу рацион, за исключением включенного исследуемого ГМО или исходного организма-реципиента. Исследуемый ГМО и исходный организм-реципиент должен быть включен в состав корма в равном количестве. Рацион не должен содержать яичный белок. Животные должны иметь доступ к корму и воде; содержаться в помещении с системой отопления и регулируемым микроклиматом.

На 1-й, 3-й, 5-й календарный день опыта крысам внутрибрюшинно должен вводиться пищевой антиген - овальбумин куриного яйца (далее - ОВА), а на 21-й календарный день эксперимента должна вводиться доза ОВА, уменьшенная в 10 раз в сравнении с дозами, введенными ранее. Кормление рационами необходимо продолжать до 29-го календарного дня эксперимента, и затем необходимо ввести внутривенно ОВА, после чего должна быть оценена на протяжении 24 часов тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по величине анафилактического индекса. Непосредственно перед внутривенным введением разрешающей дозы у крыс должна отбираться кровь в количестве 0,1 - 0,2 мл из хвостовой вены для иммуноферментного определения уровня специфических антител к ОВА.

Тяжесть реакции анафилактического шока в каждой из групп животных должна оцениваться по анафилактическому индексу, учитывающему тяжесть реакции анафилаксии, и проценту летальных реакций анафилаксии.

Вычисление анафилактического индекса должно проводиться по формуле:

где:

N - число животных, у которых наступила смерть;

N1 - число животных, у которых развился тяжелый анафилактический шок (асфиксия, общие судороги, при которых животное теряет способность удерживаться на лапах, не погибает);

N2 - число животных, у которых развился умеренный анафилактический шок (судороги, при которых животное не теряет способность удерживаться на лапах, бронхоспазм);

N3 - число животных, у которых развился слабый анафилактический шок (беспокойство, учащенное дыхание, почесывание мордочки, непроизвольное мочеиспускание, дефекация, шерсть взъерошена);

N4 - животные, у которых анафилактический шок не наступил.

Анафилактический индекс и процент летальных реакций анафилаксии группы "опыт" не должен превышать анафилактический индекс и процент летальных реакций анафилаксии группы "контроль". Уровень антител к ОВА у группы "опыт" не должен отличаться от уровня антител к ОВА группы "контроль";

в) исследования вирулентности ГМО на лабораторных животных должны проводиться на свободных от специфических патогенов мышах, цыплятах с определением летальной дозы для 50% лабораторных животных (далее - ЛД50). Определение ЛД50 проводится путем внутрибрюшинного введения по 0,1 см³ живой суточной культуры исследуемого штамма в концентрации 1 x 10(9), 1 x 10(7), 1 x 10(5) и 1 x 10(3) КОЕ/см³. Каждая группа животных должна быть размещена в отдельные клетки и в течение 10 календарных дней необходимо наблюдать за гибелью животных. В качестве контрольных групп должны использоваться группы животных, которым внутрибрюшинно вводится стерильный физиологический раствор или вирулентный штамм с установленной дозой ЛД50. По завершении эксперимента необходимо подсчитать гибель животных в каждой группе и определить ЛД50. Если ЛД50 равна 5 x 10(8) КОЕ/см³ и более штамм считается авирулентным. ЛД50 для штамма ГМО не должна быть меньше ЛД50 исходного организма-реципиента;

г) исследования микробиологических свойств, чувствительности к антибиотикам и бактериофагам, гемолитической активности на эритроцитах животных должны проводиться в отношении штаммов ГМО-бактерий. Эксперименты необходимо проводить с использованием компонентов (сред, диагностических панелей, антибиотиков, бактериофагов и иных) и методов согласно информации, представленной заявителем в соответствии с пунктом 7 настоящей Методики. Определение микробиологических свойств, чувствительности к антибиотикам и бактериофагам, гемолитической активности ГМО необходимо проводить с использованием в качестве контроля исходного организма-реципиента. Условия эксперимента для исходного организма-реципиента и ГМО должны совпадать.

Микробиологические свойства, чувствительность к антибиотикам и бактериофагам, гемолитическая активность ГМО не должны отличаться от свойств исходного организма-реципиента в части, не затронутой генетической модификацией;

д) стабильность свойств ГМО-бактерий, простейших, грибов должна проверяться при пассировании исследуемых штаммов на жидких и плотных питательных средах с тестированием фенотипических (биохимических) свойств через 6 последовательных пассажей. Молекулярно-генетическими методами должен исследоваться исходный ГМО и ГМО после шестикратного пассирования. Стабильными являются штаммы ГМО-бактерий, простейших, грибов, не изменившие фенотипических (биохимических) свойств и сохранившие генетическую структуру после проведения шестикратного пассирования. ГМО-бактерии, простейшие, грибы должны демонстрировать стабильность фенотипических (биохимических) свойств и генетической структуры;

е) исследование жизнестойкости ГМО на объектах окружающей среды, в том числе на влажных опилках, ватных тампонах, после термической обработки должно проводиться с использованием питательных сред, культур клеток или иных тест-объектов, чувствительных к исходному организму-реципиенту, согласно информации, представленной заявителем в соответствии с пунктом 7 настоящей Методики. Эксперименты должны проводиться с использованием в качестве контроля исходного организма-реципиента. Условия экспериментов для исходного организма-реципиента и ГМО должны совпадать. Жизнестойкость ГМО в окружающей среде не должна превышать жизнестойкость исходного организма-реципиента;

ж) определение инвазивности ГМО с помощью кератоконъюнктивальной пробы должно осуществляться путем внедрения ГМО и исходного организма-реципиента в качестве контроля в эпителиальные клетки конъюнктивы и роговицу лабораторных животных для оценки размножения в них. Условия эксперимента для исходного организма-реципиента и ГМО должны совпадать. Инвазивность ГМО не должна превышать инвазивность исходного организма-реципиента;

з) при определении антагонистической активности ГМО для контроля должны использоваться исходный организм-реципиент и тест-штаммы микроорганизмов, представляющие основные виды резидентной кишечной микрофлоры животных-реципиентов (грамположительные: облигатно-анаэробные бактерии-лактобактерии, бифидобактерии, пептостептококки; грамотрицательные: облигатно-анаэробные бактерии, бактероиды, факультативно-анаэробные микроорганизмы, кишечная палочка, стафилококки, стрептококки, дрожжеподобные грибы рода Candida). Уровень антагонистической активности в отношении штаммов резидентной микрофлоры должен определяться методом отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов. Антагонистическое действие ГМО не должно проявляться к представителям резидентной микрофлоры и не должно превышать антагонистическую активность исходного организма-реципиента;

и) иммунологические исследования ГМО должны проводиться на мышах линий СВА, высокочувствительных к введению эритроцитов барана и нечувствительных к гистамину и Salmonella typhimurium, и C57B1/6, низкочувствительных к введению эритроцитов барана, чувствительных к гистамину и Salmonella typhimurium, и должны включать изучение иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам: действие на гуморальное звено иммунитета в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана; действие на клеточное звено иммунитета в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана; действие как сенсибилизирующего агента в тесте чувствительности к гистамину; действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium. Эксперименты должны проводиться с использованием в качестве контроля исходного организма-реципиента. Условия экспериментов для исходного организма-реципиента и ГМО должны совпадать. ГМО должен быть не менее безопасен, чем исходный организм-реципиент.

20. Требования к проведению исследований и показатели (условия) биологической безопасности ГМО для производства кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением нежизнеспособного ГМО, являющегося микроорганизмом, или содержащих такой организм:

а) аллергологические исследования ГМО на лабораторных животных должны проводиться на крысах линии Вистар в порядке, установленном подпунктом "б" пункта 19 настоящей Методики;

б) исследования образцов кормов и кормовых добавок для животных на отсутствие жизнеспособного ГМО должны проводиться с использованием микробиологических методов. В качестве контрольных посевов и (или) пассажей должна использоваться живая культура штамма;

в) токсикологические исследования на лабораторных животных должны проводиться в соответствии с подпунктом "а" пункта 19 настоящей Методики;

г) иммунологические исследования ГМО должны проводиться в соответствии с подпунктом "и" пункта 19 настоящей Методики.