III. Хранение, оттаивание и оценка качества глубокозамороженной спермы

3.1. Глубокозамороженная сперма должна храниться в сосудах Дьюара в жидком азоте при температуре -196 °C. Контейнеры со спермой обязательно должны быть погружены в жидкий азот. Хранение спермы в парах азота недопустимо.

3.2. Использование канистр с решетчатым дном допускается при наличии специальных пластиковых стаканов-вкладышей.

3.3. Глубокозамороженная сперма должна храниться в металлических либо пластиковых контейнерах.

3.4. Объем жидкого азота в сосуде Дьюара должен составлять не менее 1/3 объема сосуда. Уровень азота в сосуде Дьюара определяют с помощью мерной линейки.

3.5. Повторное замораживание спермы после ее оттаивания не допускается.

3.6. Оттаивание глубокозамороженной спермы и оценка ее качества проводятся в соответствии с нижеприведенной последовательностью действий оператора по искусственному осеменению:

надеть чистую спецодежду;

вымыть стол и руки;

снять чехол с микроскопа;

протереть и подготовить микроскоп к работе;

отрегулировать освещение, подключить нагревательный столик, разместить на нем предметные и покровные стекла;

подготовить водяную баню с температурой +38 - 40 °C (контроль температуры осуществляется с помощью термометра);

на чистый стол поставить тампонницу с тампонами, пропитанными 70% спиртом <1>;

--------------------------------

<1> При работе визоцервикальным способом дополнительно используются тампонницы с тампонами, пропитанными 96% спиртом.

на край стола положить перчатки, канцелярские скрепки, пипетки, ампулы, салфетки и другие инструменты для искусственного осеменения, необходимые согласно применяемой технологии искусственного осеменения;

достать пинцетом 1-й тампон, обработать пальцы рук и рабочую (свободную) часть стола, тампон выбросить;

достать пинцетом 2-й тампон, обработать подставку, установить ее на рабочую часть стола, тампон выбросить;

взять 3-й тампон и обработать инструменты для искусственного осеменения и ампулу или флакон с 0,9% раствором цитрата натрия (изотон), тампон выбросить;

обработанные инструменты для искусственного осеменения разместить на подставке;

вскрыть ампулу или флакон с 0,9% раствором цитрата натрия (изотон) и поместить в водяную баню или на нагревательный электростолик для разогрева на 3 минуты (кроме работ с облицованными гранулами).

При оттаивании спермы в соломинках:

взять 4-й тампон и обработать край пакета с одноразовым инструментом для искусственного осеменения, тампон выбросить;

угол пакета надрезать стерильными ножницами и выдвинуть чехол на 1/3 длины;

надеть защитные очки и перчатки;

открыть сосуд Дьюара, быстро (не более 5 секунд) охладить бранши стерильного пинцета (корнцанга) в жидком азоте и подтянуть контейнер с соломинками к верхней трети горловины сосуда;

извлечь стерильным, предварительно охлажденным в азоте пинцетом или корнцангом одну соломинку;

удалить колебательными движениями остатки азота (не более 5 секунд) и немедленно погрузить соломинку в водяную баню;

закрыть и опустить контейнер с оставшимся соломинками в сосуд Дьюара;

закрыть сосуд Дьюара;

медленно, круговыми движениями перемещать погруженную в воду соломинку, держа ее неохлажденным пинцетом за запаянный кончик соломинки (соломинку, укупоренную стеклянными шариками, - за любой кончик). Оттаивание спермы следует проводить в течение 10 секунд при температуре воды +38 °C;

вынуть из воды соломинку и осушить ее стерильной салфеткой;

взять инструмент для искусственного осеменения в одну руку, а соломинку с оттаянной спермой в другую;

проверить, чтобы воздушный пузырек находился у запаянного кончика соломинки (у соломинки, укупоренной стеклянными шариками, - у любого кончика); при необходимости соломинку встряхнуть;

оттянуть поршень инструмента для искусственного осеменения на 90 - 120 мм (в зависимости от длины соломинки) и вставить соломинку со спермой (укупорочным пыжом или шариком к поршню инструмента для искусственного осеменения) до упора;

отрезать стерильными ножницами выступающий конец соломинки на расстоянии 7 мм строго перпендикулярно через воздушный пузырек;

надеть на подготовленный инструмент для искусственного осеменения защитный чехол и надежно зафиксировать его на инструменте для искусственного осеменения;

закрепить зажимом (канцелярской скрепкой) надрезанный край пакета.

При оттаивании спермы в необлицованных гранулах:

взять 4-й тампон и обработать край пакета с одноразовыми пипетками (катетерами), тампон выбросить;

надрезать угол пакета стерильными ножницами или проколоть его концом пипетки (катетера);

выдвинуть пипетку (катетер) на 1 - 3 длины, соединить ее при помощи муфты со стерильным инструментом для искусственного осеменения (или с полиэтиленовой ампулой);

извлечь собранный инструмент для искусственного осеменения из пакета и разместить на подставке. Открытый угол пакета закрепить зажимом (канцелярской скрепкой);

надеть защитные очки и перчатки;

открыть сосуд Дьюара, быстро (не более 5 секунд) охладить бранши стерильного пинцета (корнцанга) в жидком азоте и подтянуть контейнер с гранулами к верхней трети горловины сосуда;

извлечь стерильным, предварительно охлажденным в азоте пинцетом или корнцангом гранулу и опустить ее в подготовленную ампулу или флакон с 1 мл 2,9% раствора цитрата натрия (изотон);

закрыть и опустить контейнер с оставшимися гранулами в сосуд Дьюара;

закрыть сосуд Дьюара;

оттаивать гранулу при температуре +40 °C в течение 8 - 10 секунд до тонкого ледяного стерженька;

осторожными круговыми движениями флакона перемешать сперму, поставить флакон на стол на салфетку;

набрать сперму в инструмент для искусственного осеменения.

При оттаивании спермы в облицованных гранулах:

взять 4-й тампон и обработать край пакета с одноразовым инструментом для искусственного осеменения, тампон выбросить;

вскрыть угол пакета;

надеть защитные очки и перчатки;

открыть сосуд Дьюара, быстро (не более 5 секунд) охладить бранши стерильного пинцета (корнцанга) в жидком азоте и подтянуть контейнер с облицованными гранулами к верхней трети горловины сосуда;

облицованную гранулу быстро извлечь из сосуда Дьюара стерильным, предварительно охлажденным пинцетом с широкими браншами или корнцангом и поместить ее в водяную баню при температуре +38 °C;

оттаивать в течение 8 - 10 секунд;

осушить гранулу стерильной салфеткой и проверить ее на герметичность путем легкого сжатия между двумя пальцами руки. Негерметичные гранулы не использовать;

подготовленную гранулу заправить в инструмент для искусственного осеменения;

проколоть облицованную гранулу перед искусственным осеменением стерильной иглой.

3.7. Недопустимо оттаивать одновременно две и более доз.

3.8. С момента оттаивания до введения спермы в половые органы животного должно пройти не более 15 минут.

3.9. Оценка качества спермы проводится при температуре +38 °C на нагревательном столике под микроскопом, соблюдая последовательность действий оператора по искусственному осеменению:

на предварительно подогретое предметное стекло из инструмента для искусственного осеменения нанести каплю спермы. К капле спермы из соломинки добавить стеклянной палочкой каплю 2,9% цитрата натрия (изотон), смешать, накрыть подогретым покровным стеклом (при оценке качества спермы в необлицованных и облицованных гранулах капля 2,9% цитрата натрия (изотон) не добавляется);

подвижность сперматозоидов определить при помощи микроскопа (с увеличением в 120 - 200 раз) по 10-балльной шкале в нескольких полях зрения.

Для искусственного осеменения коров и телок используется сперма с оценкой не менее 4 баллов, то есть 4 из 10 сперматозоидов должны иметь прямолинейно-поступательное движение. Другие виды движения сперматозоидов (манежное, колебательное) при оценке качества спермы по балльной системе не учитываются. От высокоценных быков-производителей и улучшателей, а также от быков, происходящих от родителей, признанных улучшателями, допускается к использованию сперма с оценкой не менее 3 баллов.