Приготовление биотеста

В ампулу с лиофилизированной культурой вносят 0,2 мл стерильной водопроводной воды и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре.

Одну-две капли культуры засевают в 2 пробирки с бульоном (МПБ, Хоттингера, бульон питательный сухой) с 0,5% глюкозы. Суточную бульонную культуру засевают в пробирки на скошенный агар (Хоттингера, мясопептонный, сухой питательный). Для получения спор культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл стерильной водопроводной воды и переносят во флаконы со скошенным картофельно-пептонным агаром. Взвесь покачиванием флакона равномерно распределяют по поверхности среды, инкубируют при 55 °C в течение 10 - 12 суток в наклонном положении агаром вверх. Для создания достаточной влажности в термостат помещают открытые емкости с водой. На 7, 10 и 12 сутки культуру проверяют на интенсивность спорообразования. Достаточным количеством считают 80 - 90% спор в поле зрения. Культуру смывают стерильной дистиллированной водой. В целях освобождения от вегетативных клеток суспензию прогревают на водяной бане при температуре 65 - 70 °C в течение 30 мин., центрифугируют трехкратно с частотой вращения 2 000 об./мин. по 15 мин., промывая осадок стерильной дистиллированной водой после каждого центрифугирования. Отмытые споры суспендируют в стерильной дистиллированной воде в соотношении 1:1 по объему. Суспензию спор хранят в холодильнике при температуре 4 °C в стерильных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками с резиновыми колпачками (срок хранения 2 года).

Чистоту культуры на всех этапах культивирования контролируют высевом на агаровые пластинки.

Для определения титра жизнеспособных спор 0,1 мл исходной суспензии десятикратно разводят до стерильной дистиллированной водой, высевая на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл ориентировочно из разведения (предел разведения зависит от титра полученных спор). Посевы инкубируют в течение 48 ч, проводят подсчет выросших колоний. Титр жизнеспособных спор в исходной суспензии определяют как среднее арифметическое число колоний с учетом разведения исходной суспензии и объема пробы для посева.

Например, при посеве на три чашки Петри с агаром суспензии в разведении 1:100 000 () подсчитано 140, 110 и 134 колонии. Аналогичные высевы из разведения привели к образованию 12, 14 и 16 колоний; из - 5, 3 и 7 колоний. Вычисляем общее число колоний, а затем среднее количество колоний для каждого разведения 128, 14 и 5.

Из расчета посевной дозы (0,1 мл на каждую чашку) вычисляем титр жизнеспособных спор в 1 мл исходной суспензии с учетом разведения, далее находим среднее арифметическое число колоний:

128 · 10 · = 12,8 · ;

14 · 10 · = 14,0 · ;

5 · 10 · = 50,0 · .

Таким образом, титр исходной суспензии составит:

(12,8 + 14,0 + 50,0) · : 3 = 2,5 · спор в 1 мл.

Исходная суспензия должна содержать не менее 2,5 · - 2,5 · спор в 1 мл. Споры в количестве 5 · - 5 · вносят из исходной суспензии с помощью дозатора пипеточного (ТУ 64-1-3329-81) в 0,02 мл в носители (стерильные инсулиновые флакончики с ватно-марлевой пробкой или чашечки из алюминиевой фольги, разложенные в чашки Петри), подсушивают в термостате при 37 °C или в эксикаторе над осушителем (силикагель, хлористый кальций) при комнатной температуре в течение 24 ч.

Для определения фактической обсемененности исследуют не менее трех биотестов от каждой группы. Во флаконы (чашечки) вносят по 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (чашечки из алюминиевой фольги отмывают в широкогорлых пробирках с бусами в 10 мл дистиллированной воды) и встряхивают в течение 10 мин. на аппарате для встряхивания жидкостей с последующим высевом на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл суспензии из трех последовательных десятикратных разведений.

3. Определение устойчивости спор тест-культур к действию водяного насыщенного пара под избыточным давлением проводят при температуре (120 2) °C.

Биотесты в упаковочной бумаге помещают в стерилизационной коробке в камеру парового стерилизатора. После набора давления в водопаровой камере (0,11 0,01) МПа (1,1 0,1) кгс/см² проводят продувку парового стерилизатора (вытеснение воздуха паром из камеры парового стерилизатора) в течение 10 мин. при открытом спускном кране и давлении в стерилизационной камере от 0,01 до 0,02 МПа (от 0,1 до 0,2 кгс/см²). После продувки доводят давление пара в стерилизационной камере до (0,11 0,01) МПа (1,1 0,1) кгс/см², температура (120 2) °C и через 5 мин. (времени выживания спор тест-культуры) с момента установления давления спускают пар. Для уменьшения времени воздействия пара до и после экспозиции подъем давления проводят максимум в течение 8 мин., спуск - в течение 3 мин.

Аналогичное исследование проводят в течение 15 мин. времени выдержки (время гибели спор тест-культуры). Контроль температуры осуществляют максимальными термометрами. По окончании времени выдержки биотесты вынимают из стерилизатора и проводят бактериологическое исследование.

Партию биотестов считают годными для использования, если показатели устойчивости спор тест-культуры соответствуют вышеописанным требованиям.

4. Для определения эффективности работы стерилизатора в обеззараженные биотесты и контрольный тест (без стерилизации) стерильно вносят по 5 мл питательной среды, инкубируют при 55 °C в течение 7 суток при ежедневном просмотре посевов, делая высевы на агаровые пластинки из проросших емкостей.

При использовании полусинтетической среды с индикатором феноловым красным рост тест-культуры определяют по изменению красного цвета среды (pH 7,7 0,1) на желто-оранжевый (pH 6,7 0,1) за счет разложения глюкозы с образованием кислоты.

В целях исключения ложного отрицательного результата (при наличии роста тест-культуры отсутствует изменение цвета питательной среды) флаконы (пробирки) должны быть плотно закрыты стерильными резиновыми пробками (N 7,5; 12,5).

Отсутствие роста тест-культуры указывает на эффективность работы стерилизатора. Рост других культур микроорганизмов относят за счет вторичного обсеменения.

При наличии роста тест-штаммов проводится повторный контроль на удвоенном количестве биотестов. Если и при повторной проверке тест-культуры не инактивируются, осуществляют тщательный контроль технического состояния аппарата и контрольно-измерительных приборов. При отсутствии роста тест-культур в контрольном биотесте (не подвергшемся стерилизации) устанавливается причина (нежизнеспособность тест-культуры, несоблюдение методики приготовления биотестов, питательных сред, условий культивирования).

5. Для спорообразования используют:

- картофельно-пептонный агар (пептон - 5,0, мел - 1,0, агар - 25,0, картофельная вода - 1 000 мл), pH 7,1 0,1. Сырой картофель (200 г очищенного картофеля на 1 л водопроводной воды) тщательно моют, очищают от кожуры и глазков, нарезают мелкими ломтиками, заливают водопроводной водой и кипятят 30 мин. после закипания (молодой картофель употреблять нельзя). Отвар отстаивают и фильтруют в холодном состоянии через ватно-марлевый фильтр. Доводят объем фильтрата до первоначального. Устанавливают pH 7,1 0,1. Добавляют пептон и агар. Нагревают, помешивая до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, после чего добавляют мел. Разливают по флаконам, стерилизуют при 120 °C в течение 30 мин. После стерилизации среду во флаконах скашивают;

- пшеничный агар (пшеничная крупа - 500,0, агар - 25,0, дистиллированная вода - 1 000 мл), pH - 7,3 0,1.

Пшеничную крупу заливают дистиллированной водой. Через 12 ч настой аккуратно сливают, не выжимая, доводят до первоначального объема, добавляют агар и растапливают на водяной бане или в автоклаве (текучим паром 1 ч). Остывший агар выкладывают на противень и срезают осадок. Агар растапливают на водяной бане, постоянно помешивая. Устанавливают pH 7,3 0,1. Разливают во флаконы. Стерилизуют текучим паром по 1 ч в течение 3 суток. После стерилизации среду скашивают.

6. Для контроля используют бульон Хоттингера pH 7,3 0,1, агар Хоттингера pH 7,3 0,1, питательный бульон сухой pH 7,1 0,1, питательный агар сухой pH 7,3 0,1, среду питательную для контроля стерильности pH 7,1 0,1, бульон из перевара кровяных сгустков, полусинтетическую среду с индикатором феноловым красным pH 7,7 0,1 (аммоний фосфорно-кислый однозамещенный - NH4H2PO4 - 1,0 г; магний серно-кислый - MgSO4 - 0,2 г, калий хлористый - KCl - 0,2 г, глюкоза - 5,0 г, феноловый красный - 0,02 г, бульон Хоттингера с содержанием аминного азота - 140 - 160 мг - 200 мл, дистиллированная вода - 800 мл), pH 7,7 0,1. Компоненты смешивают и растворяют при нагревании на водяной бане, доводят pH до 7,7 0,1, разливают во флаконы, стерилизуют при 110 °C в течение 30 мин.