8.6. Обнаружение энтеровирусов методом полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) с использованием культуры ткани для выявления репликативной "минус" нити РНК энтеровирусов

Для подтверждения инфекционности выделенных энтеровирусов проводят первичное заражение элюатом культуры клеток, через двое суток после культивирования зараженных клеток проводят ОТ-ПЦР с культуральной жидкостью при наличии ЦПД или с лизатом клеток культур тканей при отсутствии ЦПД. Суть методики состоит в выявлении с помощью ПЦР негативной минус цепи ("-" цепи) РНК энтеровирусов после их культивирования в культуре ткани. Негативная цепь является промежуточным продуктом репликации вируса, и ее обнаружение служит косвенным доказательством потенциальной инфекционности вируса.

8.6.1. Заражение культур клеток и их последующая обработка.

Маркируют пробирки (по 2 на каждую исследуемую пробу), вносят в каждую по 0,1 мл элюата и помещают в термостат (36,5 - 37,0 °С). Для контроля оставляют по несколько пробирок с незараженной культурой (со сменой и без смены среды).

Инкубируют зараженные клетки в течение 5 суток, микроскопируя их ежедневно для контроля начала цитопатического действия. При первых признаках деградации культуры (но не позднее 5-х суток) пробирки извлекают из термостата, удаляют из них культуральную среду и промывают физраствором (или раствором Хенкса). После промывки тщательно (пипеткой) удаляют из пробирок остатки промывной жидкости.

Перед началом процедуры выделения РНК пробирки с культурой ткани, освобожденной от промывной жидкости, трижды подвергают замораживанию при -20 °С и размораживанию при 37 °С, что обеспечивает выход энтеровирусов из клеток культуры, после чего переходят к выделению РНК.

8.6.2. Выделение РНК.

Выделение РНК можно осуществлять с использованием стандартных наборов в соответствии с инструкцией производителя, например, типа "Рибозоль", "Рибосорб" и др. РНК можно хранить в течение 1 месяца в изопропаноле при -20 °С. Для длительного хранения к раствору РНК добавляют два объема 70% этанола и помещают для хранения в морозильную камеру (при -70 °С).

8.6.3. Обратная транскрипция.

8.6.3.1. Праймерные последовательности.

Праймерные последовательности можно синтезировать под заказ в организациях-производителях. Для постановки ИКК-ПЦР необходимо специально синтезировать 1 энтеровирусспецифический праймер, используемый на стадии обратной транскрипции (последовательность указана в табл. 3).