5.4. Метод концентрирования вирусов с использованием двухфазного разделения

Метод рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) "Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде", ВОЗ, 2003.

5.4.1. Область применения.

Метод концентрирования двухфазным разделением используют для индикации вирусов из 1 л очищенных и неочищенных сточных вод.

5.4.2. Подготовка реактивов (для 2-х проб по 1 л).

5.4.2.1. 22% декстран (по весу) - 40 г декстрана Т 40, 142 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при 4 °С.

5.4.2.2. 29% ПЭГ 6000 (по весу) - 363 г ПЭГ 6000 и 888 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при 4 °С. Раствор можно автоклавировать (15 мин. при 45 °С).

5.4.2.3. 150 мл (примерно) 5 М NaCl.

5.4.2.4. 1 N NaOH и 1 N HCL для установки рН.

5.4.3. Концентрирование пробы по 0,5 л.

5.4.3.1. Пробу центрифугируют в течение 10 мин. при 1000 g. Надосадочную жидкость переносят из пробирок в колбу Эрленмейра емкостью 1 л, осадок хранят при 4 °С.

5.4.3.2. Доводят рН надосадочной жидкости до нейтрального уровня (7,0 - 7,5) 1 N раствором NaOH и измеряют конечный объем надосадочной жидкости.

5.4.3.3. К 500 мл надосадочной жидкости добавляют 39,5 мл 22% раствора декстрана, 287 мл 29% раствора ПЭГ 6000 и 35 мл 5 N раствора NaCl. Тщательно перемешивают и выдерживают 1 ч при температуре 4 °С при непрерывном встряхивании или перемешивании, используя прибор горизонтального встряхивания или магнитную мешалку.

5.4.3.4. Для каждой пробы подготавливают стерильную коническую делительную воронку и закрепляют ее в штативе. Смазывают скользящие поверхности кранов, но так, чтобы не закрыть в них отверстие. Проверяют плотность кранов небольшим количеством воды. Смесь, приготовленную по п. 5.4.3.3, переливают в воронку и оставляют на ночь при 4 °С.

5.4.3.5. Утром осторожно открывают кран воронки, медленно выпускают жидкость и собирают нижний ее слой и промежуточную фазу в стерильную пробирку (обычно 5 - 10 мл от каждой пробы объемом 0,5 л.).

5.4.3.6. В полученную жидкость (п. 5.4.3.5) вносят осадок (п. 5.4.3.1), добавляют хлороформ (20% от объема образовавшейся взвеси) и встряхивают в течение 1 мин. Центрифугируют, отбирают верхнюю водную фазу в стерильную пробирку и добавляют антибиотики (пенициллин G или отечественный аналог и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл соответственно).

5.4.3.7. Помещают 1 мл полученного концентрата в холодильник с температурой -20 или -70 °С для сохранения (при необходимости дальнейшего исследования). Остаток концентрата исследуют на наличие вирусов на культурах тканей, РНК-методом ОТ-ПЦР и антигена - методом ИФА.