Приложение 19. Обработка и обеззараживание материала при проведении серологических и геннодиагностических исследований

Приложение 19

ОБРАБОТКА И ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЕ

МАТЕРИАЛА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ

И ГЕННОДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами I - II групп патогенности (бактериями, не образующими споры, хламидиями, риккетсиями и возбудителями глубоких микозов), проводится следующим способом:

- к исследуемому образцу добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10 000 (0,01%) и прогревают его при 56 °C в течение 30 мин. Затем 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинизотиоцианата, в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реагентов, и инкубируют 15 мин. при 65 °C. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) бактериями, образующими споры (возбудитель сибирской язвы), проводится следующим способом:

- исследуемый материал в количестве 0,1 мл засевают в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера, pH 7,2 и инкубируют с аэрацией при 37 °C в течение 2,5 ч. Добавляют пенициллин до конечной концентрации 1 000 ед./мл и инкубируют при 37 °C в течение 15 мин. После инкубации с пенициллином исследуемый материал прогревают на водяной бане в течение 10 мин. при температуре 100 °C. Затем 100 мкл обработанного образца переносят в пробирки объемом 1,5 мл и добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинтиоизоцианата в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реагентов, и инкубируют 15 мин. при 65 °C. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусом натуральной оспы, проводится следующим способом:

- материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 400 мкл лизирующего буферного раствора, содержащего 100 мМ Трис-HCl (pH = 8,0), 100 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1% SDS, и инкубируют 10 мин. при температуре 65 °C. Добавляют 50 мкл раствора протеиназы К (10 мг/мл), перемешивают и инкубируют в течение 1 ч при 56 °C. Центрифугируют в течение 5 мин. при 14 000 об./мин для осаждения нерастворенных частиц. Супернатант переносят в стерильные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют равный объем смеси фенол/хлороформ (pH 8,0) и тщательно перемешивают. Затем центрифугируют в течение 5 мин. при 10 000 g. Переносят верхнюю водную фазу, содержащую раствор фенола и ДНК, в новую пробирку, добавляют 1/10 по объему 3 М ацетата натрия (pH 5,5), 30 - 40 мкг РНК-носителя (1 мкл раствора РНК-носителя с концентрацией 30 - 40 мкг/мкл) и равный объем изопропанола. Затем центрифугируют в течение 15 мин. при 10 000 g при 4 °C. Полученный осадок промывают добавлением 1 мл 70% этанола и центрифугированием в течение 5 мин. при 14 000 об./мин при 40 °C. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусами I - II групп патогенности (кроме вируса оспы), содержащего инфекционную (позитивную) РНК, проводится следующим способом:

- материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 500 мкл лизирующего буфера на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и фенола (1:1) и инкубируют 20 мин. при температуре 65 °C. Затем выделяют РНК, используя метод нуклеосорбции на силикагеле, начиная с этапа добавления сорбента, либо метод осаждения РНК этанолом в присутствии 0,3 М ацетата натрия. Обратную транскрипцию выполняют в соответствии с инструкцией по применению к набору реагентов. Затем в образцы с кДНК добавляют РНКазу A до конечной концентрации 25 мкг/мл. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) вирусами I - II групп патогенности, содержащего неинфекционную (негативную) РНК или ДНК, проводится следующим образом:

- материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 500 мкл лизирующего буфера на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и фенола (1:1) и инкубируют 20 мин. при температуре 65 °C. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.

Обработка исследуемого материала, подозрительного на инфицирование высокопатогенным неизвестным возбудителем, проводится в соответствии с обработкой материала, инфицированного бактериями, образующими споры, и (или) обработкой материала, инфицированного вирусом натуральной оспы.

Режим обеззараживания суспензий внутренних органов или костного мозга животных, материала от больных людей, субстратов гнезд птиц и млекопитающих, погадок хищных птиц, а также бактериальных взвесей определяется видом возбудителя. Обеззараживают возбудителей:

- чумы добавлением проверенного на бактерицидное действие формалина до 1 - 2%-й конечной концентрации с последующей экспозицией не менее 12 ч или до 4%-й концентрации с экспозицией при комнатной температуре в течение 1 ч;

- бруцеллеза и туляремии кипячением в течение 20 мин. с последующим добавлением проверенного на бактерицидное действие формалина до 1 - 2%-й концентрации с последующим выдерживанием не менее 12 ч или до концентрации 4% с экспозицией при комнатной температуре в течение 1 ч;

- сапа и мелиоидоза добавлением формалина до 4%-й концентрации с последующей экспозицией в течение 12 ч;

- холеры кипячением в течение 30 мин.;

- сибирской язвы кипячением в течение 60 мин. с последующим добавлением формалина до 4%-й концентрации и экспозицией до 1 ч;

- глубоких микозов добавлением 10%-го раствора формалина с последующей экспозицией в течение 24 ч при комнатной температуре или в течение 2 ч при температуре (37 1) °C.