5.3.3. Патоморфологические исследования при определении остаточной вирулентности

5.83.3. Патоморфологические исследования при определении остаточной вирулентности.

5.3.3.1. Оценка нейровирулентных свойств вакцинных штаммов.

Оценка нейровирулентных свойств вакцинных штаммов проводится в двух основных тестах.

5.3.3.1.1. При введении вируса непосредственно в ЦНС (в область таламуса с двух сторон, при необходимости - в поясничное утолщение спинного мозга) экспериментальных животных. Инокуляционное повреждение должно ограничиваться зоной подкорковых ганглиев и таламической областью и не затрагивать желудочковую систему.

В этом тесте определяют:

- специфическую активность штамма (способность вызывать комплекс характерных структурных изменений в элективных зонах ЦНС);

- уровень аттенуации штамма в сравнении с его вирулентным аналогом (учитывается выраженность клинических проявлений, при микроскопическом исследовании - распространенность процесса вне области инокуляции, степень повреждения всех структурных элементов ЦНС; интенсивности вторичных реакций и циркуляторных нарушений); вирусного антигена, его локализации и накопления;

- толику и характер процесса, динамику его развития с оценкой морфологических изменений в продромальном периоде, на высоте клинических проявлений, а при отсутствии последних - в период максимальных изменений, а также в стадии регресса;

- способность штамма вызывать прогредиентную (с замедленным темпом развития морфологических изменений, образованием очагов поражений различной давности, медленным затуханием процесса) и хроническую инфекцию (с длительной персистенцией очагов поражения, с нарастанием морфологических изменений, без затухания процесса).

Сроки изучения экспериментального материала определяют с учетом особенностей инфекции.

Острая инфекция у мелких лабораторных животных (мыши, хомяки), как правило, ограничивается 20 сут., прогредиентная форма - 30 - 40 сут. У обезьян острая инфекция охватывает период до 30 сут., прогредиентная форма - не менее 3 мес.

Штаммы, вызывающие генерализованные изменения в ЦНС с накоплением вирусного антигена в различных отделах головного и спинного мозга, а также вызывающие хронические формы инфекционного процесса, не должны использоваться для приготовления живых вакцин против нейровирусных инфекций.

5.3.3.1.2. Периферическое введение вируса способом, максимально приближенным к естественному пути заражения и к методу вакцинации.

Учитывается наличие и степень повреждения нервных клеток, других структурных элементов, распространение патологического процесса по цереброспинальной оси и его динамика.

Штаммы, способные при периферическом введении преодолевать гистогематические барьеры, проникать в ЦНС и вызывать поражение нейронов, не должны использоваться для приготовления живых вакцин против нейровирусных инфекций.

Первоначальная оценка нейровирулентных свойств вакцинных штаммов при центральном и периферическом введении должна осуществляться на мелких лабораторных животных (не менее двух видов), чувствительных к вирусу.

В последующем полученные данные дополняют результатами экспериментов на обезьянах при непосредственном введении испытуемого штамма в ЦНС одним из пригодных способов с оценкой вышеуказанных для этого теста параметров. Периферический тест на обезьянах проводят только в случаях достаточной их чувствительности к такому методу заражения вирулентным аналогом.

Вопрос о специфической безопасности штамма решается на основании комплекса исследований с учетом результатов патоморфологических данных по двум указанным тестам.

Морфологический метод должен использоваться для оценки стабильности нейровирулентных свойств испытуемого штамма с учетом вышеизложенных параметров в двух указанных тестах.

Аналогичным образом проверяются 3 лабораторные серии препарата.

В дальнейшем периодичность проверки нейровирулентных свойств посевного материала и готовой вакцины определяется стабильностью генетических свойств используемого штамма.

Для проведения гистологических исследований должны применяться общепринятые нейрогистологические методики. Для выявления вирусных включений используют специальные фиксаторы и окраски (по Романовскому - Гимза, по Манну и т.д.). Для установления специфики процесса и идентификации вирусных антигенов используются иммунофлюоресцентные и иммуноферментные методики на криостатных срезах.

Гистологически должны быть исследованы все основные отделы ЦНС (кора различных долей головного мозга, при необходимости - обонятельные доли и пириформная кора; подкорковая область; образования ствола, мозжечка; различные уровни спинного мозга).

5.3.3.2. Оценка специфической безопасности живых вирусных и бактериальных вакцин.

Оценка безопасности других вирусных и бактериальных вакцин осуществляется по тем же принципам, что и живых нейровирусных вакцин, и аналогичным параметрам.

5.3.3.2.1. Оценка специфической активности вакцинного штамма и уровня его аттенуации на адекватной модели. Инфекционный агент вводят способом, обеспечивающим развитие инфекции в чувствительных органах и тканях. Учитывается характер морфологических изменений, их выраженность и развитие в динамике, способность штамма вызывать хронический процесс.

5.3.3.2.2. Введение испытуемого штамма чувствительным животным тем же способом и в той же кратности, которыми будет проводиться вакцинация, или методом, максимально приближенным к естественному пути заражения. Устанавливается способность инфекционного агента преодолевать гистогематические барьеры и вызывать повреждение чувствительных тканей или органов.

Гистологическое исследование проводят с использованием обычных и специальных методов окраски. Идентификацию вирусных и бактериальных антигенов в чувствительных тканях и органах - с помощью МФА или иммуноферментных методик на отпечатках или криостатных срезах.

Вакцинные штаммы, вызывающие генерализованные поражения или хронический процесс, не могут быть использованы для приготовления живых вакцин.

Для штаммов-кандидатов в живые вакцины для ООИ разрешение на ограниченные испытания на людях дается только после лабораторной оценки этих штаммов специальной комиссией, утвержденной Минздравом России (государственные испытания).

Вопрос о специфической безопасности штамма и первых 3-х серий вакцины решается на основе комплексных исследований с учетом данных патоморфологии по двум указанным тестам. Критерии безопасности и уровень допустимых изменений в чувствительных тканях и органах разрабатывают конкретно для каждого вида инфекции с учетом ее особенностей.

Указанный комплекс исследований может быть дополнен или сокращен в зависимости от специфики изучаемого микроорганизма. При сокращении объема исследований должно быть представлено соответствующее обоснование.

Положительные результаты испытания вакцинного штамма позволяют перейти к получению вакцинного препарата. Последний также должен быть изучен по основным показателям, которые включают в НТД.