1.4. Получение взвеси клеток селезенки

1.4. Получение взвеси клеток селезенки.

Мышей забивают с помощью хлороформа. Извлекают селезенку, взвешивают ее на торсионных весах, осторожным раздавливанием в стеклянном гомогенизаторе готовят взвесь клеток из расчета 1 мл среды 199 на 50 мг ткани селезенки. Полученную суспензию фильтруют через 2 слоя капроновой сетки.

0,5 мл взвеси спленоцитов отмывают 5 мл среды 199 путем центрифугирования в течение 10 мин. при 150 g, надосадок удаляют, а осадок разводят средой 199 с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотиками (100 ед./мл) до исходной концентрации. Необходимо подчеркнуть, что клетки селезенки каждой мыши следует использовать индивидуально, не создавая клеточных цулов. Для сравнения результатов следует использовать среднегрупповые величины.

Примечание. Для пересчета G на число оборотов, соответствующее данной центробежной силе, следует пользоваться формулой:

где:

N - число оборотов в мин.;

R - радиус от центра оси центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколл-верографина с клетками, см;

G - центробежная сила.

1.5. Определение количества Т-клеток (цитотоксический тест).

Принцип метода заключается в том, что антитела, направленные против различных лимфоцитарных антигенов, фиксируются специфически на клетках, содержащих эти антигены, и в присутствии комплемента нарушают целость клеточной мембраны. Образовавшиеся отверстия в мембране лимфоцитов позволяют прибавленному к взвеси красителю (трипановый синий) проникнуть внутрь клетки и окрашивать ее. Жизнеспособные с интактной мембраной клетки этим красителем не окрашиваются.

--------------------------------

<*> Приготовление раствора трипанового синего. Для приготовления 0,5%-ного раствора 500 мг красителя растворяют в 100 мл горячего (80 - 90 °С) 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Раствор перемешивают 10 мин. на магнитной мешалке и фильтруют через фильтровальную бумагу. Готовый раствор хранят в плотно закрытом сосуде при температуре 10 - 20 °С. Непосредственно перед употреблением раствор красителя фильтруют через тонкий слой ваты, чтобы избавиться от осадка.

Учет результатов. Определяют число погибших клеток, вычисляют их процент от общего количества клеток в препарате, подсчитывают цитотоксический индекс (ЦТИ) по формуле:

Оценка результатов. ЦТИ указывает, какой процент клеток среди исследуемой взвеси несет соответствующий антигенный маркер и, следовательно, принадлежит к данной популяции. Так, например, если при исследовании клеток селезенки ЦТИ составил 32%, можно заключить, что 32% этих клеток составляют Т-лимфоциты.