2.1.2. Выделение фракции лимфоцитов для изучения их популяционного состава

2.1.2. Выделение фракции лимфоцитов для изучения их популяционного состава.

В бактериологические пробирки разливают забуференный 0,9%-ный раствор хлорида натрия рН 7,2 - 7,3 <**> (или раствор Хенкса, или среду 199) но 2,0 мл, добавляют равный объем гепаринизированной крови. Разведенную таким образом вдвое кровь отбирают пастеровской пипеткой и наслаивают на смесь фиколл-верографина <***> (1,5 мл). Соотношение объема смеси к объему разведенной крови может составлять 1:2 - 1:5. Между кровью и фиколл-верографином определяется четкая граница, одного, уже в первые минуты после наслаивания, эритроциты крупными хлопьями начинают опускаться на дно емкости. Пробирки с кровью и градиентом плотности центрифугируют при 400 g 30 - 40 мин.

--------------------------------

<**> Приготовление 0,9%-ного раствора хлорида натрия буферного (рН 7,2). К 7,0 хлорида натрия добавляют 2,0 г двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,3 г однозамещенного фосфорнокислого калия, доводят до 1000 мл ТДВ, рН 7,2.

<***> Приготовление смеси фиколл-верографина (плотность 1,077). Смесь готовят на тридистиллированной автоклавированной воде (ТДВ): а) Из 76%-ного раствора верографина готовит 33,9%-ный раствор (плотность 1,200); к 33,9 мл 76%-ного верографина добавляют 42,1 мл ГДВ; б) 9%-ный раствор фиколла (плотность 1,025): к 10,8 г фиколла добавляют 109,2 мл ТДВ (подогретой до 30 - 40 °С); в) соединяют 7 частей раствора верографина и 16 частей раствора фиколла: к 52,5 мл верографина добавляют 120 мл фиколла. Плотность смеси измеряют ареометром, плотность смеси должна быть 1,077. Смесь хранят в темном флаконе в холодильнике при 6 - 8 °С две недели.

В результате центрифугирования образуются фракции: 1-я сверху - слегка опалесцирующая - плазма крови и буферный раствор; 2-я - белый диск, содержащий мононуклеарные клетки крови; 3-я - прозрачная - градиент фиколл-верографина; 4-я - осадок эритроцитов и гранулоцитов.