1.1. Определение фагоцитарной активности макрофагов

1.1. Определение фагоцитарной активности макрофагов.

Клетки перитонеального экссудата (КПЭ) выделяют асептически от

3 - 5 мышей опытной и контрольной групп и помещают в среду 199,

содержащую 5 МЕ гепарина в 1 мл, в пробирки, стоящие на льду. Не

используют экссудаты, содержащие эритроциты. После осаждения (150

g, 10 мин.) клетки ресуспендируют в среде 199 с 10% сыворотки

крупного рогатого скота с антибиотиками (100 ед./мл). Концентрацию

клеток доводят до 1,0 - 2,0 х 106 кл./мл и суспензию разливают по

2 мл в чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки помещают в термостат при

температуре (37 +/- 2) °С с содержанием 5% СО Через 60 мин.

смывают неприлипшие клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей

среды и оставляют на 18 - 24 ч в термостате с 5 - 7% СО при

температуре (37 +/- 2) °С.

Клетки для исследования фагоцитоза можно получать также на половинках покровных стекол, помещенных в пробирки с 1,5 - 2 мл КПЭ.

Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана, дрожжеподобные грибы Candida albicans или лабораторный штамм Staphylococcus (N 9198) или любые другие микробные клетки.

Эритроциты барана (ЭБ) <*> трижды отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия, осаждая на центрифуге при 800 g в течение 5 мин. Готовят 0,5%-ную взвесь ЭБ на среде 199.

--------------------------------

<*> Кровь барана, взятую в консервант крови, можно хранить до 10 сек. при 6 - 8 °С.

Суточные культуры живых или убитых прогреванием при

температуре (90 +/- 2) °С в течение 45 - 60 мин. микроорганизмов

отмывают путем центрифугирования не менее 3-х раз 0,9%-ным

раствором хлорида натрия, ресуспендируют в нем и определяют

концентрацию суспензии по стандарту оптической мутности. Взвесь

разводят средой 199 до концентрации, соответствующей

предварительно установленному соотношению (1,0 - 2,0 кл./мл).

В чашки Петри, содержащие КПЭ, наливают 1 мл свежей среды и вносят по 1 мл взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов. Через 30 - 60 мин. чашки ополаскивают холодным раствором Хенкса, подсушивают и фиксируют 10 мин. метанолом. Окрашивают азур-эозином по Романовскому - Гимза.

Учет результатов. Просматривают не менее 200 клеток, подсчитывая фагоцитирующие клетки и количество содержащихся в них ЭБ или микробов.

Результаты выражают процентом фагоцитирующих клеток (ПФ) и фагоцитарным числом (ФЧ), которое определяется количеством частиц на один фагоцит.

1. Методы доклинического испытания иммунологической безопасности вакцин 1.2. Исследование селезенки