2.3.3. Определение фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов

2.3.3. Определение фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов.

В силиконированной <*> стерильной пробирке смешивают 0,2 мл

гепаринизированной крови (25 ед./мл крови) и 0,1 мл взвеси

культуры микроорганизма в концентрации 1 - 2 х 10 кл./мл. Смесь

клеток инкубируют в течение 1 ч при температуре (37 +/- 2) °С и

затем готовят мазки на предметном стекле. Приготовленные таким

образом препараты высушивают на воздухе при температуре

18 - 20 °С, фиксируют этиловым спиртом или метанолом в течение

(10 +/- 1) мин. и окрашивают 0,5%-ным раствором метиленового

синего или раствором метилового зеленого пиронина <**> - в течение

60 мин. После окрашивания мазки ополаскивают водой, промокают

фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе при температуре

(18 - 20) °С. Работу по окрашиванию препарата проводят в

лабораторном химическом шкафу с вытяжкой.

--------------------------------

<*> Силиконирование посуды. Чистые пробирки ополаскивают силиконом, помещают в фильтровальную бумагу вверх дном для того, чтобы стекли остатки силикона из пробирок, выдерживают в таких условиях в течение 1 ч, затем помещают их в сушильный шкаф на 1,5 ч при температуре 120 - 140 °С, затем промывают пробирки дистиллированной водой и вновь выдерживают в сушильном шкафу в указанном режиме. Работу по силиконированию посуды проводят в лабораторном химическом шкафу с вытяжкой.

<**> Приготовление краски метиловый зеленый пиронин. Предварительно готовят растворы "а" и "б", перед использованием смешивают указанные растворы в соотношении 1:1. Раствор "а" состоит из смеси следующего состава: 17,5 мл 5 %-ного водного раствора пиронина, 10 мл 2%-ного раствора метилового зеленого (метиловый зеленый должен быть предварительно промыт хлороформом и высушен на воздухе), 250 мл дистиллированной воды. Раствор "б" - ацетатный буферный раствор в концентрации 0,2 моль/куб. м, рН 4,8.

Приготовление ацетатного буферного раствора 0,2 М рН 4,8. К 120 мл раствора ацетата натрия в концентрации 0,1 моль/куб. м (16,3 г ацетата натрия на 1 л дистиллированной воды) доливают около 80 мл раствора уксусной кислоты той же концентрации (4,61 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л дистиллированной воды), доводят рН раствора до 4,8.

Учет результатов. В мазке под микроскопом с масляной иммерсией сосчитывают число клеток с фагоцитированным материалом на 200 - 300 полиморфноядерных лейкоцитов и количество поглощенных клеток в каждом лейкоците. Оценку фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови проводят по следующим показателям процент фагоцитоза (ПФ) - относительное количество лейкоцитов крови, обладающих фагоцитарной активностью, выраженной в процентах; фагоцитарное число (ФЧ) - количество поглощенных клеток из расчета на один лейкоцит; абсолютный фагоцитарный показатель (АФП) - суммарный показатель активности полиморфноядерных лейкоцитов крови, рассчитывают по формуле:

АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл х ФЧ.

Подсчитывают количество полиморфноядерных лейкоцитов в 1 мкл крови, затем определяют количество фагоцитирующих лейкоцитов в 1 мкл крови.

Пример: общее количество лейкоцитов 1 мкл крови - 5000 с содержанием полиморфноядерных лейкоцитов - 60%

ПФ - 80%

ФЧ - 5

а) общее число лейкоцитов 5000 - 100% полиморфноядерных лейкоцитов Х - 60%

полиморфноядерных лейкоцитов = 3000

б) полиморфноядерных лейкоцитов 3000 - 100%

фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов Х - 80%

фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов = 2400

в) АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл крови х ФЧ

АФП = 2400 х 5 = 1200

Приготовление реактивов (см. сноски <*>, <**>).

2.3.2. Определение лейкоцитарной формулы 2.3.4. Определение численности Т-клеток, зрелых Т-клеток, Т-супрессоров, Т-хелнеров, В-клеток, киллеров методом непрямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами