2.9.1. Титриметрический метод

Метод основан на экстрагировании витамина C раствором кислоты (соляной, метафосфорной или смесью уксусной и метафосфорной) с последующим титрованием визуально или потенциометрически раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия.

Аппаратура, материалы, реактивы. Весы лабораторные; гомогенизатор; pH-метр-милливольтметр лабораторный; мешалка магнитная с плавным регулированием частоты вращения; секундомер с точностью 0,2 с; воронки лабораторные диаметром от 5 до 10 см; колбы мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 150, 1000, 2000 куб. см; микробюретка с ценой деления не более 0,01 куб. см; колбы лабораторные стеклянные вместимостью 50, 100, 250 куб. см; палочки стеклянные; пипетки мерные лабораторные стеклянные на 1, 2, 5, 10, 20, 25 куб. см; стаканы лабораторные стеклянные вместимостью 50, 100, 1000 куб. см; ступка и пестик лабораторные фарфоровые соответственно с наружным диаметром 70 или 90 мм и высотой 90 мм; цилиндры мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250 куб. см; бумага фильтровальная лабораторная; песок кварцевый очищенный и прокаленный; вода дистиллированная; ацетон; 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия, раствор массовой концентрацией 0,250 г/куб. дм; кислота аскорбиновая, должна соответствовать требованиям Государственной фармакопеи СССР, изд. X, растворы массовыми концентрациями 1,0 и 0,1 г/куб. дм; кислота азотная плотностью 1,14 г/куб. см, раствор с массовой долей 20%; кислота метафосфорная, растворы с массовой долей 3 и 6%. Раствор с массовой долей 3% готовят в день испытания разбавлением раствора с массовой долей 6%. Раствор с массовой долей 6% хранят в холодильнике в течение 10 дней; кислота соляная плотностью 1,19 г/куб. см, раствор с массовой долей 2%; кислота уксусная ледяная и раствор с массовой долей 3%; кислота хлорная, раствор концентрации 0,1 моль/куб. дм, готовят перед обработкой электродов; кислота этилендиаминтетрауксусная или двунатриевая соль кислоты, раствор с массовой долей 5%; йодид калия, раствор с массовой долей 1%, в растворе уксусной кислоты с массовой долей 3%, готовят перед обработкой электродов; ацетат натрия плавленый, насыщенный раствор (200 г соли растворяют в 300 куб. см воды); формальдегид, раствор с массовой долей 36 - 40%.

Допускается применение импортной аппаратуры, лабораторной посуды и реактивов по классу точности и качеству не ниже отечественных. Для проведения испытания, если нет других указаний, применяют реактивы квалификации "чистый для анализа" и дистиллированную воду или воду эквивалентной чистоты.

Подготовка к испытанию. Приготовление экстрагирующего раствора. В качестве экстрагирующего раствора используют растворы кислот - соляной с массовой долей 2%, метафосфорной с массовой долей 3% или смеси уксусной и метафосфорной кислот, которую готовят следующим образом: 15 г метафосфорной кислоты растворяют в 250 куб. см дистиллированной воды, прибавляют 40 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят водой до объема 500 куб. см, перемешивают и фильтруют в склянку с притертой пробкой. Хранят в холодильнике не более 10 дней.

Приготовление стандартных растворов аскорбиновой кислоты. Для приготовления раствора аскорбиновой кислоты концентрации 1,0 г/куб. дм взвешивают 0,1 г аскорбиновой кислоты с точностью до +/- 0,0001 г, растворяют в экстрагирующем растворе в мерной колбе вместимостью 100 куб. см, доводят до метки тем же раствором и перемешивают. Для приготовления раствора концентрации 0,1 г/куб. дм вносят пипеткой 10 куб. см раствора аскорбиновой кислоты концентрации 1,0 г/куб. дм в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, доводят до метки экстрагирующим раствором и перемешивают. Растворы аскорбиновой кислоты неустойчивы, поэтому их готовят перед проведением испытания.

Приготовление раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия и определение его титра. 0,05 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия растворяют приблизительно в 150 куб. см горячей воды, предварительно прокипяченной в течение 30 мин. или содержащей 0,042 г бикарбоната натрия, охлаждают до комнатной температуры, доводят до объема 200 куб. см той же охлажденной водой, перемешивают, фильтруют в темную склянку. Раствор хранят в холодильнике не более 10 суток. Титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия устанавливают по стандартному раствору аскорбиновой кислоты концентрации 1,0 или 0,1 г/куб. дм в день проведения испытания. Для этого в две колбы вместимостью 50 или 100 куб. см, в которые предварительно прибавлено по 9 куб. см воды, вносят пипеткой по 1 куб. см раствора аскорбиновой кислоты и быстро титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до светло-розовой окраски, не исчезающей в течение 15 - 20 с. Одновременно проводят контрольное испытание. Для этого в колбу вместимостью 50 или 100 куб. см вносят 1 куб. см экстрагирующего раствора, 9 куб. см дистиллированной воды и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия в граммах аскорбиновой кислоты, эквивалентного одному кубическому сантиметру раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (Т), вычисляют по формуле:

Приготовление раствора ацетатного буфера с pH 4. Растворяют 300 г безводного ацетата натрия в 700 куб. см дистиллированной воды, добавляют 1000 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают и с помощью pH-метра устанавливают pH 4, добавляя при необходимости снова кислоту.

Подготовка электродов для потенциометрического титрования. Измерительный платиновый электрод помещают в стакан вместимостью 50 куб. см с раствором азотной кислоты, кипятят от 5 до 10 мин., промывают дистиллированной водой и оставляют в воде на 2 - 3 суток. Затем измерительный и вспомогательный электроды опускают в стакан вместимостью 100 куб. см с раствором хлорной кислоты и замыкают накоротко (т.е. соединяют клеммы между собой). Через 2 ч электроды вынимают, не размыкая, промывают дистиллированной водой и помещают в стаканы вместимостью 50 куб. см: измерительный - с раствором йодида калия, вспомогательный - с дистиллированной водой. Через 15 мин. электроды размыкают, измерительный электрод промывают дистиллированной водой. Обработке подвергают электроды, не бывшие в употреблении или после перерыва в работе более 6 мес. Хранят в стакане с дистиллированной водой.

Проведение испытаний. Экстрагирование. Для приготовления экстракта навеску пробы массой от 5 до 50 г взвешивают с точностью до 0,01 г.

Величину навески и разбавление определяют из ориентировочного содержания витамина C в продукте, чувствительности метода, а также из того, что проба для титрования должна содержать 0,10 - 0,15 мг аскорбиновой кислоты.

Так, при содержании витамина C до 10 мг на 100 г навеска должна составлять 25 - 50 г в объеме 200 - 250 куб. см, при содержании порядка 40 - 50 мг в 100 г - навеска 5 г в объеме 100 куб. см. Так, для сиропа из плодов шиповника, плодов шиповника очищенных, пюре из шиповника с сахаром, хвои - 5 г; чая витаминизированного плиточного - 2 - 5 г; хлеба витаминизированного - 60 г; молока витаминизированного - 5 куб. см; плотной части первого и третьего блюд, плодово-ягодных сладких блюд - 20 - 30 г; жидкой части первого и третьего блюд - 20 - 50 куб. см; супов-пюре - 20 - 50 г.

Для экстрагирования витамина C из сухих продуктов навеску пробы от 5 до 10 г растирают в ступке с небольшим количеством экстрагирующего раствора кислоты или смеси кислот (не менее 1 куб. см раствора на 1 г пробы) и песка, переносят в мерную колбу или мерный цилиндр вместимостью 100 куб. см, смывая ступку и пестик небольшими порциями экстрагирующего раствора до тех пор, пока объем не достигнет метки. Содержимое выдерживают в течение 10 мин., перемешивают и фильтруют.

Для экстрагирования витамина C из продуктов плотной консистенции навеску пробы от 5 до 50 г гомогенизируют не более 2 мин. с небольшим количеством экстрагирующего раствора (не менее 1 куб. см раствора на 1 г пробы) и переносят в мерную колбу или цилиндр вместимостью 100 куб. см, обмывая гомогенизатор небольшими порциями экстрагирующего раствора до тех пор, пока объем не достигнет метки. Содержимое выдерживают в течение 10 мин., перемешивают и фильтруют.

Для экстрагирования витамина C из жидких продуктов навеску пробы от 5 до 50 г переносят в мерную колбу или цилиндр вместимостью 100 куб. см, обмывая стенки стакана небольшими порциями экстрагирующего раствора до тех пор, пока объем не достигнет метки. Содержимое выдерживают в течение 10 мин., перемешивают и фильтруют.

При исследовании продуктов, фасованных в металлическую тару, навеску пробы от 5 до 30 г обрабатывают, как указано выше, переносят в мерную колбу или цилиндр вместимостью 100 куб. см при помощи экстрагирующего раствора, доводят до объема 50 куб. см и перемешивают. Через 10 мин. прибавляют 10 куб. см насыщенного ацетата натрия или 30 куб. см раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты или ее соли, перемешивают, доводят объем до метки экстрагирующим раствором, снова перемешивают и фильтруют.

Полученные экстракты сразу используют для титрования.

Визуальное титрование. В колбу вместимостью 50 или 100 куб. см пипеткой вносят от 1 до 10 куб. см экстракта, полученного, как описано выше, доводят объем водой до 10 куб. см и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 15 - 20 с.

Одновременно проводят контрольное испытание на содержание в продукте редуцирующих веществ. Для этого в колбу помещают такой же объем экстракта, как указано выше, прибавляют равный ему объем ацетатного буферного раствора, раствор формальдегида, равный половине объема буферного раствора, перемешивают и выдерживают в течение 10 мин., закрыв предварительно колбу пробкой. Затем содержимое титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия.

Потенциометрическое титрование. В стакан вместимостью 50 куб. см вносят пипеткой объем экстракта, полученного, как указано выше, но не более 25 куб. см, прибавляют экстрагирующий раствор приблизительно до объема 30 куб. см и погружают электроды pH-метра-милливольтметра так, чтобы при перемешивании они не касались магнитного стрежня мешалки. Затем титруют потенциометрически из микробюретки раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия прибавляют порциями по 0,1 - 0,2 куб. см при постоянном перемешивании. Записывают показания прибора в милливольтах, соответствующие каждому прибавленному раствору 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. При титровании стрелка прибора сначала отклоняется влево, затем ее движение замедляется, и после точки эквивалентности стрелка отклоняется вправо. Объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, соответствующий точке эквивалентности и, следовательно, израсходованный на титрование объема, устанавливают по максимальной разнице ("скачку") двух соседних показаний прибора или по понтециометрической кривой зависимости величины потенциала в милливольтах от объема раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия в кубических сантиметрах.

Одновременно проводят контрольное титрование на содержание в продукте редуцирующих веществ, как указано выше. Раствор титруют потенциометрически. За результат титрования принимают среднее арифметическое результатов двух титрований одного экстракта. При повторном титровании в области предполагаемой точки эквивалентности раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия прибавляют по 1 - 2 капли.

Обработка результатов. Массовую долю аскорбиновой кислоты (Х, %) вычисляют по формуле:

Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 3% от среднего арифметического значения при доверительной вероятности Р = 0,95.