VII. Порядок работы

7.1. Подготовительным этапом работы является проведение на наборах реагентов <11> реакции ОТ.

--------------------------------

<11> Пример методики представлен на наборах реагентов, указанных на официальном сайте: www.amplisens.ru (в открытом доступе). Примечание: допускается использовать наборы реагентов с аналогичными характеристиками.

Для данной работы с РНК рекомендуется использовать одноразовые пластиковые расходные материалы, имеющие маркировку "Не содержащий РНК" (англ. "RNase-free"), "Не содержащий ДНК" (англ. DNase-free") или подвергшиеся автоклавированию.

На подготовительном этапе работы компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед проведением реакции ОТ.

Стандартный конечный объем реакции ОТ - 20 мкл, объем РНК-пробы - 10 мкл. Полученную в реакции ОТ кДНК разводят буфером в 2 раза (40 мкл кДНК - на 4 реакции ПЦР).

При использовании методики определения геновариантов "Омикрон" и "Дельта" требуется 60 мкл кДНК, необходимо увеличить объем реакции ОТ и всех реагентов в 2 раза: конечный объем - 40 мкл, объем РНК-пробы - 20 мкл.

Готовый препарат кДНК может храниться при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C в течение недели, при температуре от минус 24 до минус 16 °C в течение 6 месяцев и при температуре не выше минус 68 °C в течение года.

7.2. Проведение ПЦР-РВ.

7.2.1. Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора. Для внесения в пробирки реагентов, проб кДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами.

7.2.2. Подготовка пробирок для проведения амплификации при помощи комплекта реагентов.

7.2.3. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, включая объем пробы кДНК - 10 мкл.

7.2.4. Реагенты перемешать на вортексе и осадить капли с крышек пробирок.

Для приготовления реакционных смесей стерильные пробирки объемом 1,5 мл поставить в штатив "рабочее место", промаркировать их.

7.2.5. Смешать каждую реакционную смесь в отдельной пробирке:

- (N + 1) x 10 мкл ПЦР-смеси-FL (название каждой смеси соответствует названию выявляемой мутации);

- (N + 1) x 5 мкл ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT и (N + 1) x 0,5 полимеразы (TaqF), где N - количество исследуемых образцов кДНК.

7.2.6. Перемешать реакционные смеси на вортексе и осадить капли с крышек пробирок.

7.2.7. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации и расставить в штативе "рабочее место".

7.2.8. Внести в пробирки для амплификации по 15 мкл готовых реакционных смесей.

7.2.9. В пробирки с реакционными смесями добавить по 10 мкл проб кДНК, полученных на этапе ОТ.

7.2.10. Поставить контрольные реакции:

- отрицательный контрольный образец ПЦР (К+) - внести в пробирку 10 мкл К- (ТЕ-буфер);

- в качестве положительного контрольного образца ПЦР (К+) возможно использование кДНК подтвержденных секвенированием образцов (при наличии) - внести в пробирку 10 мкл кДНК образца с соответствующей мутацией.

7.2.11. Запрограммировать амплификатор, установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора и провести ПЦР-РВ. Программа амплификации указана в табл. 1.

Таблица 1

Программа амплификации

7.3. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР-РВ (роторного или планшетного типа с наличием не менее двух оптических каналов).

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции, имеющей экспоненциальный подъем, с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла (далее - Ct).

Анализ результатов для каждой реакционной смеси проводится отдельно. Для анализа необходимо задать пороговую линию для каждой реакционной смеси, соответствующую величине 10% от среднего значения флуоресценции образцов по каждому каналу.

Кривая флуоресценции пересекает пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции. При неочевидном экспоненциальном подъеме (т.е. линия флуоресценции похожа на прямую линию), следует проанализировать необработанные данные. Если в необработанных данных экспоненциальный подъем флуоресценции отсутствует, результат по этой пробе считать отрицательным.

7.4. Интерпретация и выдача результатов исследования. Детекция результатов, полученных с реакционными смесями, проводится по каналам, указанным в табл. 2.

Таблица 2

Детекция результатов по соответствующим каналам

Детектируемая мутация считается обнаруженной, если определено значение Ct по соответствующему каналу детекции, табл. 3.

Таблица 3

Интерпретация результатов

7.5. Результаты анализа считаются достоверными только при отсутствии амплификации (недетектируемых значений Ct) в отрицательных контрольных образцах для каждой ПЦР-смеси-1.