4.1.1. Стандартные методы разжижения и деконтаминации

Перед посевом исследуемый материал необходимо гомогенизировать и освободить от сопутствующей гноеродной и гнилостной микрофлоры. Для этого мокроту, экссудаты и другой негомогенный материал собирают в стерильные флаконы со стеклянными бусами или битым стеклом, добавляют щелочь или кислоту и подвергают встряхиванию.

ВСЕ ПРОЦЕДУРЫ ПО ПЕРЕНОСУ МАТЕРИАЛА ИЗ ОДНОЙ ПОСУДЫ В ДРУГУЮ ПРИ ОБРАБОТКЕ И ПОСЕВЕ ПРОИЗВОДЯТСЯ ТОЛЬКО СТЕРИЛЬНЫМИ ПИПЕТКАМИ. ЗАПРЕЩАЕТСЯ ПЕРЕНОС МАТЕРИАЛА ПУТЕМ ПЕРЕЛИВАНИЯ ЕГО ЧЕРЕЗ КРАЙ ФЛАКОНОВ, ПРОБИРОК И ПР.

Жидкие материалы предварительно центрифугируют и обработке подвергают только осадок.

Все реактивы, используемые при приготовлении растворов для обработки диагностических материалов, должны иметь степень очистки не менее категории "химически чистый" (ХЧ). Могут использоваться как отечественные, так и импортные реактивы, имеющие степень очистки не менее чем "химически чистый".

Для предпосевной обработки диагностического материала рекомендуется использовать следующие методы и детергенты.

4.1.1.1. Обработка материала 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия

Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4) хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2 - 3-дневном хранении материала при +4 °C не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.

1. Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе с 6 - 8 стеклянными бусинами или битым стеклом, залить равным объемом 10% трехзамещенного фосфата натрия и поместить на 10 мин. во встряхиватель.

2. Флакон с материалом поместить на 18 - 20 часов в термостат при 37 °C.

3. После этого материал стерильной пипеткой объемом 5 - 10 мл перенести в пробирки, уравновесить их и центрифугировать при 3000 x g <*> в течение 15 минут. При указанном режиме происходит осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.

--------------------------------

<*> Ускорение центрифугирования ("относительная сила центрифугирования" (ОСЦ)) измеряется в относительных единицах к ускорению свободного падения "g". Формула расчета ОСЦ:

ОСЦ = 1,12Rmax (об./мин./1000)² ,

где: Rmax - максимальный радиус от центра вращения ротора до дна пробирки в мм.

Например, при R = 180 мм и 1500 об./мин. (центрифуга ЦЛ1-3) ОСЦ = 450g. При увеличении частоты вращения до 3000 об./мин. ОСЦ возрастает до 1800g. Необходимое число оборотов в мин. можно рассчитать по формуле:

Об.мин.^-1 = 1000 .

4. Надосадочную жидкость отобрать стерильной пипеткой на 10 - 5 мл и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в каждой пробирке 1,2 - 1,5 мл осадка.

5. Использованную пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором.

6. К осадку стерильно добавить несколько капель 6% соляной кислоты до получения нейтрального значения pH, определяемого индикаторной бумажной полоской.

7. Встряхнуть пробирку с осадком и поместить ее в штатив в порядке регистрационных номеров материала.

8. Для снижения токсичного воздействия на микобактерии различных остатков веществ (в том числе возможных химиопрепаратов) вводят еще одну процедуру отмывки 10 - 15 мл дистиллированной воды.

Супернатант удаляют, а осадок в объеме 0,8 - 1,0 мл готовят к инокулированию и приготовлению мазка.

Далее см. разделы 4.3.1. Процедура посева и 4.3.2. Инкубация и др.

Реактивы.

Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4) - ГОСТ 4274-76;

Кислота соляная (HCl) концентрированная - ГОСТ 3118-77;

Бумага индикаторная универсальная - ТУ 6-09-1181-76.

Приготовление растворов.

1. 100 г трехзамещенного фосфата натрия растворяют в 800 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до 1 л.

2. 6 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 94 мл дистиллированной воды.

НИКОГДА НЕ ДОБАВЛЯТЬ ВОДУ В КИСЛОТУ!

4.1.1.2. Обработка материала 3% серной кислотой

ОБЩЕЕ ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ КИСЛОТОЙ НЕ ДОЛЖНО ПРЕВЫШАТЬ 20 МИН.!

Несмотря на то, что микобактерии туберкулеза не теряют жизнеспособности в сильно закисленной среде, необходимо помнить, что длительная экспозиция материала в растворе серной кислоты губительно действует на микобактерии. Поэтому раствором серной кислоты производят обработку материала, содержащего большое количество сопутствующей микрофлоры. Этот метод рекомендован для обработки мочи, гнойных экссудатов и отделяемого ран, резецированных тканей, органов экспериментальных животных и пр.

При обработке 3% раствором серной кислоты рекомендуется следующий порядок манипуляций:

1. Для работы правильно собранный материал (60 - 100 мл) используют целиком для получения осадка, так как микобактерии, имея удельный вес, близкий к 1,0, могут подолгу не оседать, находясь во взвешенном состоянии.

2. Из этого материала методом наслоения поэтапным центрифугированием получить осадок. Для этого перенести в 1 - 2 центрифужные пробирки приблизительно по 15 - 20 мл материала.

3. Уравновесить пробирки и центрифугировать материал при 3000 x g в течение 15 мин.

4. Надосадочную жидкость отобрать пипеткой на 10 - 5 мл и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в каждой пробирке 0,8 - 1,2 мл осадка.

5. Полученные в разных пробирках осадки одного и того же материала с помощью той же стерильной пипетки перенести в одну пробирку, плотно закрыть ее пробкой и встряхнуть.

6. Использованную пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором.

7. К полученному осадку добавить равный объем 3% раствора серной кислоты.

8. Выдержать полученную с кислотой смесь 10 мин. при комнатной температуре (не превышать время экспозиции!).

9. Центрифугировать смесь при 3000g в течение 10 мин. (не превышать время экспозиции!).

10. Стерильной пипеткой на 5 - 10 мл отобрать надосадочную жидкость и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив приблизительно 0,8 - 1,2 мл осадка.

11. К осадку добавить стерильной пипеткой 15 мл стерильного 0,9% раствора хлористого натрия.

12. Пробирки уравновесить и повторно центрифугировать материал при 3000g в течение 15 мин.

13. Стерильной пипеткой на 5 - 10 мл отобрать надосадочную жидкость и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив приблизительно 1,5 мл осадка.

14. Добавить в пробирку 1 - 2 капли 4% едкого натра до получения нейтрального значения pH, определяемого индикаторной бумажной полоской.

15. Встряхнуть пробирку с осадком и поместить в штатив, расположив ее по порядку регистрационных номеров материала.

Далее см. разделы 4.3.1. Процедура посева и 4.3.2. Инкубация и др.

Реактивы:

1. Серная кислота (H2SO4) концентрированная - ГОСТ 4204-77.

2. Едкий натр (NaOH) - ГОСТ 4328-77.

Приготовление растворов

1. 3% раствор серной кислоты. К 97 мл дистиллированной воды добавляют 3 мл концентрированной серной кислоты, осторожно наслаивая ее по стенкам сосуда.

ВНИМАНИЕ! КИСЛОТУ СЛЕДУЕТ ДОБАВЛЯТЬ В ВОДУ, А НЕ НАОБОРОТ!

НЕ ПИПЕТИРУЙТЕ КОНЦЕНТРИРОВАННУЮ СЕРНУЮ КИСЛОТУ РТОМ!

2. 4% раствор едкого натра. 40 г NaOH заливают дистиллированной водой до объема 1 литр.

Обработка материала 4% раствором едкого натра

(модифицированный метод Петрова)

ОБЩЕЕ ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ МАТЕРИАЛА ЩЕЛОЧЬЮ НЕ ДОЛЖНО ПРЕВЫШАТЬ 40 МИН.!

Обработка с помощью NaOH является достаточно жесткой и может приводить к гибели до 60% микобактерий, содержащихся в исследуемом образце материала. Данный показатель не зависит от дополнительной гибели бактерий за счет повышенной температуры при центрифугировании и других факторов.

Гидроокись натрия токсична по отношению как к загрязняющим микроорганизмам, так и к микобактериям туберкулеза.

Поэтому при использовании данного метода необходимо строго соблюдать указанное время обработки.

1. Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе с 6 - 8 стеклянными бусинами или битым стеклом, залить двойным объемом 4% раствора едкого натра и поместить на 10 мин. во встряхиватель.

2. Выдержать полученную со щелочью смесь 15 мин. при комнатной температуре с периодическим ручным встряхиванием (не превышать время экспозиции!).

3. Стерильной пипеткой объемом 5 - 10 мл перенести обработанный материал в пробирки.

4. Пробирки уравновесить и центрифугировать материал при 3000g в течение 15 мин.

5. Стерильной пипеткой объемом 5 - 10 мл перенести надосадочную жидкость в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в пробирке 0,8 - 1,2 мл осадка.

6. К осадку добавить стерильной пипеткой 15 мл стерильного 0,9% раствора хлористого натрия.

7. Пробирки уравновесить и повторно центрифугировать материал при 3000g в течение 15 мин.

8. Стерильной пипеткой объемом 5 - 10 мл перенести надосадочную жидкость в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в пробирке 1,2 - 1,5 мл осадка.

9. К осадку добавить 1 - 2 капли 10% раствора соляной кислоты до получения нейтрального значения pH, определяемого индикаторной бумажной полоской.

10. Закрыть пробирку и встряхнуть ее содержимое.

11. Пробирку с осадком поместить в штатив, расположив ее по порядку регистрационных номеров материала.

Реактивы.

1. Едкий натр (NaOH) - ГОСТ 4328-77.

2. Кислота соляная (HCl) концентрированная - ГОСТ 3118-77.

Приготовление растворов.

1. 4% раствор едкого натра. 40 г едкого натра заливают дистиллированной водой до объема 1 литр.

2. 10% раствор соляной кислоты. 10 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 90 мл дистиллированной воды.

Растворы стерилизуют 20 мин. при 1 атмосфере.